كلون سازي و بيان ژن رمزكننده آنزيم لاكاز قارچ Trametes در ميزبان مخمري و تعيين خصوصيات كينتيكي و بيوشيميايي آنزيم

Cloning and expression of fungal Trametes Laccase gene in yeast host and characterization of recombinant enzyme biochemical properties and kinetic parameters

لاكاز متعلق به خانواده پلي فنول اكسيداز است و به دليل خواص ساختاري و عملكردي در حذف آلودگي­ هاي زيست محيطي اهميت بسيار زيادي دارد. اخيرا قابليت اكسيداسيون مواد فنلي و غير فنلي لاكاز مورد توجه بسياري از محققان قرار گرفته است. هدف از اين پژوهش، توليد لاكاز نوتركيب و تعيين خصوصيات بيوشيمايي و كينتيكي آنزيم است. از آنجائيكه قارچ Trametes قابليت توليد مقدار اندك لاكاز را دارد، جهت توليد انبوه، توالي آمينواسيدي لاكاز شناسايي و توالي ژني مطابق ترجيج كدوني ميزبان مخمري Pichia pastoris، طراحي و سنتز شد. ژن لاكاز سنتزي تحت كنترل پروموتور قوي القايي AOX و سيگنال پپتيد αMF در ناقل PpinkαHC كلون سازي و پس از انتقال به ميزبان متيلوتروف Pichia pastoris داخل ژنوم اينتگره شد و به ترتيب در محيط­ هاي بيانيBMGY و القاييBMMY با متانول به صورت خارج سلولي بيان شد. پس از بررسي­ كمي و كيفي آنزيم، خصوصيات فيزيكوبيوشيميايي آنزيم نوتركيب تعيين شد. بررسي فعاليت لاكازي سوپرناتانت مخمرهاي ترانسفورم شده، بيان خارج سلولي آنزيم نوتركيب فعال را نشان داد. بررسي سوپرناتات نشان داد وزن مولكولي لاكاز نوتركيب 65 كيلو دالتون است. همچنين بررسي ويژگي­هاي بيوشيميايي لاكاز نوتركيب، محدوده pH اسيدي وسيع با pH بهينه 4/8 و نتايج سنجش پروفايل دمايي، بهينه دماي C°60 را نشان داد. با بررسي پارامترهاي كينتيكي، µM140= Km تعيين شد كه نتايج بدست آمده نشان داد لاكاز نوتركيب با مقدار توليد انبوه و خصوصيات فيزيكوشيميايي مناسب با معيارهاي صنعتي، به صورت فعال و خارج سلولي بيان شده است. آنزيم لاكاز نوتركيب بيان شده قابليت كاربري در صنايع متعدد دارويي، غذايي و استفاده در بيوتكنولوژي جهت پاكسازي محيط زيست را دارد.

Laccases have received much attention from researchers in last decades due to their ability to oxidase both phenolic and non-phenolic lignin related compounds as well as highly recalcitrant environmental pollutants, which makes them very useful for their application to several biotechnological processes. Despite of Trametes Laccase wildly application as detoxification of industrial effluents, its native low expression, makes it unsuitable for industrial application. In this study, heterologous expression of Trametes Laccase gene in methylotrophic yeast, P.pastoris with αMF as signal peptide and PpinkαHC expression vector under methatol induction in BMGY and BMMY media was investigated and expressed active recombinant laccase biochemical and biophysical properties in compare with native Trametes Laccase was studied. According to codon performance of P.pastoris, Trametes Laccase gene sequence designed and synthetic genes under control of inducible AOX1 promoter was successfully high expressed as active form in yeast host, SDS-PAGE analysis showed the recombinant laccase in size of 65KDa with Km=140µM.Analysis of Laccase biochemical and biophysical properties demonstrated that recombinant Laccase has wide pH profile with pH optima 4.8 and optimum temperature of 60 °C with high activity in P.pastoris host. We conclude that recombinant P.pastoris Laccase could fulfil a serried of predefined industrial quality criteria to be used in industry like, broad pH optimum ,substrate specify and proper thermal stability. Therefore studied methylotrophic yeast could be an appropriate host for expression and production of recombinant Laccase, with industrial application.