ساخت و تعيين خصوصيت سلول نوتركيب T 293HEK با بيان بالاي 3Tim

مقدمه: گليكوپروتئين 3Tim (3T-cell immunoglobulin and mucin domain) يكي از نشانگرهاي سطح سلولي سلول‌هاي 1Th (1T helper) است كه در بسياري از بيماري‌هاي مرتبط با سيستم ايمني، تغيير بيان دارد. اين مطالعه، با هدف بررسي و افزايش بيان پروتئين 3Tim در سطح سلول T293 انجام شد. روش‌ها: كاست بياني 3Tim از روي پلاسميد 67M-2682W-EX با استفاده از پرايمرهاي داراي جايگاه آنزيمي NheI و MluI تكثير و در جايگاه‌هاي مربوط در پلاسميد pHygro ساب كلون شد. پلاسميد نوتركيب محتوي ژن 3Tim (3pH-Tim) پس از استخراج و خالص‌سازي، با آنزيم NheI خطي شد و در سلول‌هاي T293 با استفاده از روش كلسيم فسفات ترانسفكت شد. سپس سلول‌هاي نوتركيب T293 بيان كننده‌ي 3Tim در محيط حاوي هيگرومايسين انتخاب مثبت شدند. پس از يك ماه بر روي DNA ژنوميك كلون‌هاي سلولي باقي‌مانده، واكنش PCR (Polymerase chain reaction) به منظور بررسي ادغام 3cDNATim (Complementary DNA) در ژنوم سلول T293 انجام شد. همچنين ميزان بيان پروتئين 3Tim در سطح سلول به روش فلوسايتومتري ارزيابي گرديد. يافته‌ها: نتايج هضم آنزيمي با آنزيم‌هاي NheI و MluI بر روي پلاسميد 3p-H-Tim باند 2312 و 4600 جفت بازي را نشان داد كه تأييد كننده‌ي صحت كلونينگ است. در واكنش PCR بر روي DNA ژنوميك، باند 1100 جفت بازي تكثير شد كه نشانه‌ي ورود ژن 3Tim در ژنوم سلول T293 مي‌باشد. همچنين در فلوسايتومتري، 88 درصد سلول‌ها از نظر بيان 3Tim مثبت بودند و شدت بيان در قسمت زيادي از سلول‌ها بالا بود. نتيجه‌گيري: بيان پروتئين در سيستم‌هاي بياني پروكاريوت‌ها از نظر زمان و هزينه بهتر از سيستم‌هاي يوكاريوتي است، اما در مورد پروتئين‌هاي داراي تغييرات پس از ترجمه، اين سيستم بياني جوابگو نيست. در برخي موارد ساختار فضايي طبيعي پروتئين در موقع لنگر انداختن بر سطح غشا، در توليد پروتئين‌هاي غشايي مانند 3Tim در سيستم‌هاي يوكاريوتي، حفظ نمي‌شود. در نتيجه، براي استفاده در تحقيقات تهيه‌ي آنتي‌بادي‌هايي كه اپي‌توپ‌هاي فضايي را مي‌شناسند و يا انتخاب آپتامر، مناسب نمي‌باشند. بيان پروتئين 3Tim در سطح سلول، مي‌تواند ارايه دهنده‌ي پروتئين با ساختار فضايي طبيعي در پروژه‌هاي توليد آنتي‌بادي، نانوبادي و آپتامر باشد.