ساخت و تعيين خصوصيت سلول نوتركيب HEK با بيان بالاي TOSO/FAIM3 و ارزيابي بيان آن

مقدمه: پروتئين‌هاي غشايي در فرايندهاي سلولي با ارزش شامل انتقال سيگنال، عبور و مرور مواد و ارتباطات سلولي نقش دارند و به منظور درمان بيماري‌ها و اختلالات، مورد هدف داروها قرار مي‌گيرند. سيستم‌هاي بياني متفاوتي براي توليد ميزان زيادي از اين پروتئين‌ها به كار رفته‌اند كه سلول‌هاي پستانداران با توليد ساختارهاي نزديك به فرم طبيعي اين پروتئين‌ها مناسب‌ترين آن‌ها هستند. TOSO/FAIM3 (Fas apoptosis inhibitory molecule)، يك پروتئين غشايي به شدت حفاظت شده است كه نقش مهمي را در بقا، نظارت بر سيستم ايمني و هموستاز بر عهده دارد. هدف از اين مطالعه، بيان TOSO به ميزان زياد در سطح سلول HEK-293T (Human embryonic kidney-293T) مي‌باشد. روش‌ها: وكتور بياني يوكاريوتيك pEZ-M67-TOSO به منظور تكثير پلاسميد در باكتري Escherichia coli سويه‌ي TOP10F’ ترانسفورم شد. سپس، پلاسميد استخراج شد و با آنزيم محدودالاثر Eco31I مورد هضم آنزيمي قرار گرفت تا پلاسميد خطي شود. پس از آن، سلول‌هاي HEK-293T با پلاسميد خطي ترانسفكت شدند و به منظور غربالگري سلول‌هاي پايدار بيان كننده‌ي TOSO، تحت تيمار با هيگرومايسين قرار گرفتند. كلون‌هاي مقاوم پس از سه هفته تكثير شدند. سپس، DNA كروموزومي از سلول‌هاي ترانسفكت شده استخراج شد و حضور cDNA TOSO در ژنوم HEK-293T به وسيله‌ي روش PCR (Polymerase chain reaction) مورد سنجش قرار گرفت. علاوه بر اين، براي بررسي ميزان بيان TOSO از روش Real-time PCR استفاده گرديد. يافته‌ها: ورود cDNA TOSO در داخل ژنوم سلول‌هاي انتخاب شده، تأييد گرديد. سلول‌هاي HEK-293T، mRNA TOSO را به ميزان متوسط 1700 مولكول در هر سلول بيان كردند. نتيجه‌گيري: سلول‌هاي HEK-293T به دليل سهولت در ترانسفكشن و رشد سريع، مناسب‌ترين گزينه براي بيان پروتئين مي‌باشند. بيان غشايي پروتئين TOSO حتي نسبت به پروتئين نوتركيب خالص شده از سيستم بياني رده‌ي سلولي پستانداران نيز تاخوردگي طبيعي‌تري دارد. از رده‌ي سلولي HEK-293T ساخته شده در اين تحقيق كه با بيان بالاي TOSO همراه بود، در مطالعات بعدي جهت تعيين خصوصيت و ساختار بيوفيزيكي و بيوشيميايي آن و تحقيقات دارويي و زيستي مي‌توان استفاده نمود.