تخليص فراكشن هاي زهر مار كبري ايراني به روش كروماتوگرافي ژل فيلتراسيون و HPLC فاز معكوس و بررسي فعاليت آنتي باكتريال پپتيد هاي جدا شده بر سويه هاي باكتريايي استاندارد

Fractionation of the Venom of Iranian Cobra Snake by Gel Filtration Chromatography and Reverse-Phase HPLC and Evaluation of Antibacterial Activity of Isolated Fractions on Standard Bacterial Strains

زمينه و هدف: سال ها است كه عفونت هاي سپتي سمي، عفونت سوختگي و پريتونيت مقاوم به آنتي بيوتيك از بيمارستان هاي زيادي گزارش مي شود و هنوز هيچ نوع آنتي بيوتيكي تضمين كننده درمان قطعي نيست. يكي از راه حل هاي پيشنهاد شده جهت رفع اين مشكل، استفاده از پپتيد هاي آنتي ميكروبيال است. هدف اين تحقيق جستجوي يك پپتيد آنتي ميكروبيال از زهر مار كبري ايراني و همچنين تعيين سميت آن بر روي گلبول هاي قرمز انسان بود. روش كار: در اين مطالعه ابتدا زهر مار كبري به روش ژل كروماتوگرافي فيلتراسيون فراكشن گيري شده و فعاليت آنتي باكتريال فراكشن ها بر سويه هاي استاندارد مورد بررسي قرار گرفت. هر كدام از فراكشن ها كه فعاليت ضد باكتري داشت، انتخاب شده و با تكنيك كروماتوگرافي HPLC فاز معكوس فراكشن گيري گرديد. سپس فعاليت آنتي باكتريال فراكشن هاي بدست آمده بررسي شده و هر كدام كه مثبت بود فعاليت هموليتيك آن نيز آزمايش گرديد. يافته ها: محدوده وزن مولكولي پپتيد ها و پروتئين هاي زهر مار كبري از حدود 7 الي 170 كيلو دالتون برآورد گرديد. بر اساس نتايج كروماتوگرافي ژل فيلتراسيون، تعداد 8 فراكشن مشاهده گرديد. بيشترين سطح زير منحني مربوط فراكشن هاي انتهايي 6، 7 و 8 بود. MIC فراكشن پپتيدي شماره 6 و 7 عليه باكتري استافيلوكوكوس اورئوس و اشرشيا كلي برابر با g] 50 بدست آمد. فراكشن 7 به دليل مقدار بيشتر پپتيد جهت انجام HPLC انتخاب گرديد. تعداد 12 peak در كروماتوگرامر HPLC مشاهده و جمع آوري گرديد. بيشترين اثر آنتي باكتريال مربوط به فراكشن هاي 4، 9، 10، و 12 بود كه از ميان آن ها فراكشن 12 بيشترين اثر را از خود نشان داد. MIC فراكشن پپتيدي 12 بر روي اشريشيا كلاي، استافيلوكوكوس اورئوس و سودوموناس آئروژينوزا به ترتيب برابر با 6 / 25 ، 25 و 50 ميكروگرم بدست آمد ولي در آسينتوباكتر MIC پپتيد بيشتر از 100 ميكروگرم بود. پپتيد F12 فاقد هر گونه فعاليت هموليتيك بود. نتيجه گيري: در اين مطالعه مشخص شد كه پپتيد مار كبري ايراني داراي اثر باكتري سيدال مي باشد و هيچ گونه سميتي بر روي گلبول هاي قرمز انسان ديده نشد. استفاده از تركيبات طبيعي مانند پپتيدهاي آنتي باكتريال كه از زهر جانوران سمي استخراج مي گردند، مي تواند راهگشاي مقابله با پاتوژن هاي مقاوم به آنتي بيوتيك در آينده باشد. اين مطالعه از اين لحاظ حائز اهميت است كه اولين گزارش وجود يك عامل ضد ميكروبي پپتيدي از زهر مار كبري ايراني است.

Background and Objective For many years, antibiotic resistant infections including septicemia, burn infection, and peritonitis have been reported from many hospitals and still no antibiotic guarantees comprehensive treatment. Antimicrobial peptides are one of suggested solutions to overcome the problem. The goal of this study was tracing for an antimicrobial peptide in the venom of Iranian cobra snake, Naja naja oxiana and evaluation of its toxicity on human Red Blood Cells as well. Materials and Methods Snake venom was firstly fractionated using Gel filtration chromatography. The resulted fractions controlled for antibacterial activity against E. coli and Staphylococcus aureus. The fractions responsible for antibacterial activity were fractionated by Reverse Phase- HPLC. All major peaks were collected and controlled for activity against E. coli. Positive fractions selected to examination of activity against Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853), Acinetobacter baumannii (ATCCBAA747), and Staphylococcus aureus (ATCC29213). Toxicity of candidate antibacterial fraction was evaluated by in vitro hemolysis assay. Results The weight of proteins and peptides approximately ranged from 7KDa to 170 KDa. According to results, 8 fractions were obtained gel filtration chromatography. Among 8 fractions only 3 fractions were peptide and had the most area percent. Three fractions, F6, F7, and F8, selected for determination of MIC against E. coli and S. aureus. Two fractions had antibacterial activity at 50µg for both of examined bacteria. As the amount of fraction F7 was greater than F6, it was candidated for further fractionation by HPLC. 12 peaks were eluted and collected from column. Among the fractions, F4, F9, F10, and F12 were more effective against E. coli. Fraction 12 had the most activity as compared to the others. The weight of F12 approximately estimated as an 8KDa peptide. The MIC for F12 against E. coli, Staphylococcus aureus, and Pseudomonas aeruginosa were determined at 6.25, 25, and 50µg respectively. Conclusion We could find a bactericidal peptide. It is the first report for antibacterial activity of Iranian cobra snake venom. This peptide did not show any direct or indirect hemolytic activity. Natural compounds like antimicrobial peptides derived from venomous animals could be an effective solution to deal with multidrug resistant pathogen.