مطالعه و بررسي اثرات مهار ژن هايackA ، pta و poxB به وسيله ي RNA ي آنتي سنس روي ترشح استات و بيان اينترفرون بتاي نوتركيب در باكتري اشريشيا كلاي

Effects of ackA, pta and poxB inhibition by antisense RNA on acetate excretion and recombinant beta interferon expression in Escherichia coli

اشريشيا كلاي يكي از رايج ترين سيستم باكتريايي براي توليد پروتيين هاي نوتركيب دارويي محسوب مي شود. توليد بيش از حد اسيد استيك (استات) به عنوان يك محصول ناخواسته ي جانبي، مانعي بر سر راه استفاده از اي. كلاي به شمار مي رود. در اين پژوهش، براي حل مشكل ترشح اضافي استات، از يك روش مهندسي متابوليك مبتني بر فناوري آنتي سنس استفاده شد. مواد و روش ها يك پلاسميد نوتركيب حاوي توالي كد كننده اينترفرون نوتركيب بتاي انساني و سه قطعه آنتي سنس بر عليه ژن هاي استات كيناز، فسفوترانس استيلاز و پيروات اكسيداز طراحي شد. اثرات ايجاد شده توسط آن بر فيزيولوژي سلولي و بيان اينترفرون بتا و غلظت استات در باكتري اي. كلاي بررسي شد. يافته ها غلظت mRNA ژن هاي هدف گيري شده در سويه ي حاوي قطعات آنتي سنس در مقايسه با سويه ي كنترل كم تر شده بود. با استفاده از فناوري آنتي سنس، غلظت استات در محيط كشت كاهش يافته بود. بيان قطعات RNA آنتي سنس تاثير نامطلوبي بر روند رشد سلولي ايجاد نكرد. به علاوه، بيشينه ي مقدار اينترفرون بتاي نوتركيب در سويه ي كنترل شده با فناوري آنتي سنس در مقايسه با سويه ي كنترل بيش تر شده بود. نتيجه گيري استفاده از فناوري آنتي سنس به منظور مهندسي متابوليك چرخه ي استات در اي. كلاي موفقيت آميز بود. فناوري توصيف شده در اين پژوهش، قابليت به كار گرفته شدن براي توليد ساير پروتيين نوتركيب دارويي، را دارا مي باشد.

Escherichia coli (E.coli) is one of the most widely used hosts for the production of recombinant proteins. The main problem in getting high product yields and productivity is the accumulation of acetic acid (acetate) as an unwanted metabolic by-product. In this study, an antisense-based strategy as a metabolic engineering approach was employed to hamper the acetate excretion problem. Materials and Methods A recombinant plasmid containing the encoding genes for human recombinant interferon beta (rhINF-β) and three antisense oligonucleotides against acetate kinase, phosphotransacetylase and pyruvate oxidase B was designed. The effects of recombinant plasmid on the cell physiology, rhINF-β production and acetate excretion were studied in E. coli. Results The mRNA levels of the targeted enzymes were lowered in antisense-regulated cells compared to the control cells. The concentration of acetate in culture media was decreased due to the constructed plasmid. The expression of antisense RNA did not affect the cell growth, negatively. Besides, the rhINF-β production was enhanced in antisense-regulated strain compared to the control plasmid without antisense genes. Conclusion Application of an antisense strategy on the acetate pathway was successful in metabolically engineering E. coli. This enhancement of production yield by antisense technology suggests that this strategy may be successfully applied to high cell density fermentations of E. coli expression system to overexpress other recombinant proteins.