همسانه سازي و بيان هترولوگ لاكاز در Pichia pastoris و تعيين خصوصيات بيوشيميايي لاكاز نوتركيب

Cloning and heterologous expression of Laccase in Pichia pastoris and determination of some biochemical properties

لاكازها آنزيم ­هايي حاوي مس مي ­باشند كه اكسيداسيون تركيبات آروماتيك و غيرآروماتيك را از طريق احياي مولكول اكسيژن به آب كاتاليز مي­ كنند . همچنين به دليل قابليت اكسيداسيون طيف وسيعي از تركيبات فنلي كاربرد وسيعي در صنعت دارند. در اين مطالعه توالي نوكلئوتيدي ژن لاكاز بر اساس ترجيح كدوني ميزبان مخمري Pichia pastoris GS115 بهينه شد، سپس توسط شركت اينويتروژن سنتز و در حامل بياني pPICZ alpha A همسانه سازي شد و تحت پيشبر AOX1 به مخمر پيكيا پاستوريس به روش الكتروپوريشن منتقل شد. به منظور تعيين شرايط بهينه بيش بيان آنزيم، در سطوح مختلفي از دما، غلظت مس و متانول القاي بيان صورت گرفت و فعاليت آنزيم در هريك از سطوح ارزيابي شد. بيش بيان آنزيم در غلظت 0/4 ميلي­ مولار مس و 0/8 درصد متانول و دماي 25 درجه سانتي­گراد به دست ­آمد. بيش بيان ترشحي لاكاز در شرايط بهينه U/L 9600 به دست­آمد. پس از بررسي كيفي و كمي آنزيم برخي خصوصيات بيوشيميايي آنزيم تعيين شد. دما و pH بهينه لاكاز نوتركيب به ترتيب40 درجه سانتي­گراد و 3 تعيين شد. بررسي پايداري دمايي و pH لاكاز نشان داد كه اين آنزيم پايداري بالايي در برابر حرارت داشته و قادر به فعاليت در طيف وسيعي از pH مي­ باشد. بررسي خصوصيات كينتيكي آنزيم با استفاده از سوبستراي ABTS، mM 0/089 Km= تعيين شد. نتايج اين تحقيق نشان داد كه مخمر پيكيا پاستوريس مي­تواند كانديداي مناسبي براي بيان لاكاز نوتركيب به منظور استفاده در صنايع متعدد جهت پاكسازي پساب، بيوسنسور و ساير كاربردها باشد.

Laccase (EC 1.10.3.2) enzymes are multi-copper oxidase which catalyze the oxidation of aromatic and non- aromatic compounds with electron reduction of molecular oxygen to water. These enzymes catalyze the oxidation of a wide array of phenolic compound and have been used in different industrial field. In this study, Nucleotide sequence of laccase (accession number: AY081188.1) was optimized according to the codon preference of Pichia pastoris. Laccase gene was synthesized and cloned into pPICZalpha A. under control of AOX1 promoter then transformed to P. pastoris by electroporation. Methanol concentration, copper salts concentration and temperature were varied in order to enhance laccase expression in the heterologous system. Optimal fermentation condition for laccase production in shake flask cultivation using BMGY medium were obtained by presence of 0.4 mM Cu+2, at 25°C culture temperature, by 0.8% methanol added into culture every 24 h. the volumetric activity was achieved 9600 U/L after 12-day culture in fernbach flask. The biochemical properties of recombinant laccase and kinetic parameters were studied. The laccase activity was optimal at pH 3 and 40°C. Its Km value was 0.089 mM For ABTS [2, 2´azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphoric acid)]. The result of this study was showed that Pichia pastoris can be useful tool for heterologous laccase expression in order to use in industrial application such as wastewater treatment, biosensor & etc.