بررسي مولكولي ژن هاي مولد كولي باكتين كلبسيلا پنومونيه جدا شده از شير خام با روش Multiplex-PCR به عنوان عامل ابتلا به سرطان كلوركتال

Molecular analysis of the genes encoding colibactin production in Klebsiella pneumoniae isolated from raw milk by Multiplex-PCR as an agent for colorectal cancer

كلبسيلا پنومونيه باكتري گرم منفي، غير متحرك، داراي كپسول، تخمير كننده لاكتوز، بي هوازي اختياري و ميله ­اي شكل است. آن از ديرباز به عنوان پاتوژن فرصت­ طلب مورد توجه قرار گرفته است و يك علت شايع عفونت ­هاي بيمارستاني است. خوشه ژني pks آنزيم­ هايي را توليد مي­ كند كه مسئول توليد سنتز كولي­باكتين هستند. كولي­باكتين يك ژنوتوكسين است كه باعث آسيب به DNA مي­ شود و با افزايش ويرولانس مرتبط است. همچنين حدس زده مي­ شود كه كولي­باكتين در توسعه سرطان كولوركتال نقش داشته باشد. در اين مطالعه شيوع ژن­ هاي pks، clbN و clbB در جدايه­ هاي كلبسيلا پنومونيه مورد بررسي قرار گرفت. در اين مطالعه 220 نمونه از شير خام به دست آمد. سپس تمام نمونه ­ها در محيط كشت ويولت رد بايل آگار و سپس بلاد آگار، مك كانكي آگار و شكلات آگار براي جداسازي باكتري­ ها كشت شدند. آزمايش­ هاي بيوشيميايي و ميكروبيولوژي براي تاييد باكتري انجام شد. DNA از تمام جدايه ها با استفاده از كيت استخراج DNA ژنومي استخراج شد. سپس واكنش زنجيره اي پليمراز چندگانه با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي انجام شد. يافته­ ها نشان داد كه 60 مورد از كلبسيلا پنومونيه از 220 نمونه (27/27 درصد) جداسازي شده با استفاده از تست ­هاي فنوتيپي استاندارد مورد تاييد قرار گرفتند. آزمون PCR نشان داد كه 6 سويه (10 درصد) داراي ژن­ هاي clbB و clbN بودند. كلبسيلا پنومونيه pks مثبت در نمونه ­هاي ما شايع بود. با توجه به اثرات پليوترروپيك آن، كولي­باكتين عميقا بر فيزيولوژي سلولي اثر مي­ گذارد، باعث ايجاد اختلالات DNA مي­ شود كه منجر به پير شدن يا آپوپتوزيس مي­ شود. به نظر مي­ رسد شناسايي كلبسيلا پنومونيه pks مثبت در شير بسيار ضروري براي جلوگيري از سرطان كلوركتال است.

Klebsiella pneumoniae is a Gram-negative, non-motile, encapsulated, lactose-fermenting, facultatively anaerobic, rod-shaped bacterium.It has traditionally been considered an opportunistic pathogen and is a common cause of nosocomial infections. The pks gene cluster encodes enzymes responsible for the synthesis of colibactin. Colibactin is a genotoxin that has been shown to induce DNA damage and contribute to increased virulence. Colibactin is also strongly suspected of being involved in the development of colorectal cancer. The present study investigated the prevalence of pks, clbN, and clbB genes in Klebsiella pneumoniae isolates. In this study, 220 samples were obtained from raw milk. Then, all samples were cultured in the violet red bile agar and then cultured in blood agar, MacConkey agar, and chocolate agar for bacterial isolation. Biochemical and microbiological tests were performed for confirmation of the bacteria. DNA was extracted from all isolates using a genomic DNA extraction kit. Then multiplex polymerase chain reaction (M-PCR) method was performed using specific primers. It was found that 60 K. pneumonia isolates out of 220 samples (27.27%) were confirmed by standard phenotypic tests. The PCR test indicated that 6 (10%) strains carried clbN and clbB genes. The pks positive K. pneumoniae was more prevalent in our samples. Owing to its pleiotropic effects, colibactin profoundly influences cellular physiology, inducing DNA breaks that lead to senescence or apoptosis. It seems that the identification of the pks positive K. pneumoniae in milk is essential to prevent colorectal cancer.