پديد آورندگان :
اسعدي، ياسمن دانشگاه تهران - پرديس علوم - گروه بيوتكنولوژي، ايران , خالقي، ريحانه دانشگاه تهران - پرديس علوم - گروه بيوتكنولوژي، ايران , اسد، صديقه دانشگاه تهران - پرديس علوم - گروه بيوتكنولوژي، ايران
كليدواژه :
ال-آسپاراژيناز نوتركيب , بهينه‌كردن , يك فاكتور در زمان , پروتئين محلول
چكيده فارسي :
مقدمه: آنزيم ال-آسپاراژيناز (EC 3.5.1.1) نقش مهمي در درمان سرطان و به‌ويژه لوسمي حاد لنفوئيدي دارد. حذف سريع آنزيم از جريان خون، فعاليت گلوتامينازي و همچنين ايجاد واكنش ايمني در بدن از معايب آنزيم‌هاي تجاري است و ازاين‌رو، شناسايي ال-آسپاراژينازهاي جديد با ويژگي‌هاي مطلوب ضروري است. ژن بيان‌كنندۀ ال-آسپاراژيناز مشتق‌شده از باكتري نمك‌دوست هالوموناس الانگاتا كه پيش‌تر ويژگي‌هاي مطلوب آن به‌منظور درمان سرطان گزارش شده به‌شكل نوتركيب در اشريشيا كلي توليد شده است؛ اما بخش اعظم پروتئين نوتركيب به‌شكل نامحلول در سلول باقي مي‌ماند.
مواد و روشها: در مطالعۀ حاضر، ابتدا دو ميزبان اشريشيا كلي BL21 (DE3) و ArcticExpress (DE3) براي بيان پروتئين به‌شكل محلول مقايسه شدند. پس‌از انتخاب ميزبان، اثر عوامل مختلف ازجمله محيط‌كشت، غلظت القاكننده، ميزان مايۀ تلقيح، زمان و دماي القا و ميزان هوادهي به روش يك فاكتور در زمان بهينه شد.
نتايج: بر اساس يافته‌ها، بيشترين مقدار توليد ال-آسپاراژيناز فعال مربوط به ميزبان اشريشيا كلي BL21 (DE3) در محيط كشت LB با افزودن 1 درصد مايۀ تلقيح، 5/0 ميلي‌مولار IPTG و سرعت برهم‌زدن 150 دور‌بردقيقه حاصل شد؛ همچنين بيشترين فعاليت ويژۀ ال-آسپاراژيناز به بيان در دماي 37 درجه سانتي‌گراد و براي مدت زمان 9 ساعت تعلق داشت. در مرحله بعد، اثر افزودني‌هاي مختلف به محيط‌كشت بررسي و مشاهده شد افزودن 2 درصد اتانول و 200 ميلي‌مولار آرژينين تأثير چشمگيري بر افزايش فعاليت ويژۀ آنزيم دارد.
بحث و نتيجهگيري: درنهايت، اِعمال شرايط بهينه سبب افزايش مقدار فعاليت ويژه از حالت پايۀ تقريباً 1000 واحد‌بر‌ميلي‌گرم به حدود 3500 واحد‌بر‌ميلي‌گرم (بيش از سه برابر) شد.
چكيده لاتين :
Introduction: L-asparaginase has an essential role in the treatment of cancers, especially Acute Lymphoblastic Leukemia. The rapid removal of the enzyme from the bloodstream, glutaminase activity, and also inducing an immune response in the body are disadvantages of commercial enzymes, therefore, the identification of new L-asparaginase with desirable properties is essential. Previously, the coding sequence of L-asparaginase isolated from Halomonas elongata had been cloned in E. coli and had shown to have advantageous properties as a chemotherapeutic agent. However, it was mostly expressed as inclusion bodies.
Materials and methods: In this study, soluble enzyme expression was examined in two E. coli hosts, BL21 (DE3) and ArcticExpress strains. After selecting the host, the effects of various factors such as culture media, inducer concentration, inoculum size, induction duration, temperature, and also aeration rate were optimized using the one-factor-at-a-time approach.
Results: Based on the results, the highest amount of active L-asparaginase production was related to Escherichia coli host Bl21 (DE3) strain in LB culture medium by adding 1% inoculum size, after 9 h induction with 0.5 mM IPTG at 37 ˚C, and shaking at 150 rpm. In the next step, the effect of various additives on the culture medium was investigated and it was observed that the addition of ethanol 2% (v/v) or arginine (200 mM) has a significant effect on increasing the specific activity of the enzyme.
Discussion and conclusion: Finally, the optimization could increase soluble L-asparaginase production from 1000 U/mg in the basal condition up to approximately 3500 U/mg (more than three times).
