توليد و خالص سازي فيتاز اسيدي و قليايي از قارچ آسپرژيلوس نايجر و باكتري هاي نوتركيب اشرشياكلي و باسيلوس سابتيليس با هدف دستيابي به يك تركيب مفيد در جيره طيور

Production and Purification of Acid and Alkaline Phytase enzyme from Native Aspergillus Niger Fungi, Recombinant Escherichia Coli and Bacillus Subtilis Bacterias Aiming a Beneficial Combination for Poultry Diet

به منظور افزايش قابليت دسترسي فسفر و ساير مواد معدني در جيره طيور و تك معده اي ها و كاهش آلودگي محيطي، اين پژوهش با هدف توليد آنزيم فيتاز جهت هضم اسيد فيتيك در مجراي گوارشي طيور انجام گرفت. بدين منظور، فيتاز قارچ آسپرژيلوس نايجر روي محيط كشت PSM و فيتازهاي اشرشياكلي و باسيلوس سابتليس با استفاده از فن آوري DNA نوتركيب توليد شدند. آنزيم ها با استفاده از ستون كرماتوگرافي نيكل سفارز(Ni-NTA) و Q- سفارز خالص سازي شده و با استفاده از الكتروفورز سديم دودسيل سولفات پلي آكريل آميد (SDS-PAGE) ، وزن ملكولي آنزيم ها به ترتيب براي فيتاز قليايي باسيلوس سابتليس (PhyC)، فيتاز اشرشيا كلي (appA) و فيتاز قارچي آسپرژيلوس نايجر (PhyA) حدود42، 44 و 66 كيلو دالتون تخمين زده شد. فعاليت فيتاز براي PhyC ،appA و PhyA به ترتيب 81/54، 49/35 و 33/29 (U/ml) تعيين شدند. با مقايسه پارامترهاي كنتيكي نشان داده شد كه آنزيم PhyC مي تواند در دماي 90 درجه سانتيگراد فعال و داراي پايداري حرارتي باشد، درحاليكه آنزيم appA داراي بهترين دامنه فعاليت و راندمان آنزيمي با pH حدود 4 تا 5/4 در لوله گوارشي مي باشد. در اين خصوص، بيشترين ميل تركيبي آنزيم به سوبسترا با Km برابر 09/0 ميلي مولار براي آنزيم فيتاز اسيدي اشرشيا كلي(appA) رخ مي دهد. طبق نتايج بدست آمده، تركيب مناسبي از اين آنزيم ها مي تواند كارايي قابل قبولي براي هيدروليز فيتاز در مجراي گوارشي پرندگان داشته باشد.

In order to increase the availability of phosphorus and other minerals in the diet of birds and monogastrics and reduce environmental pollution this reasearch was aimed to produce phytase. This was designed to produce a suitable enzyme for digestion of phytate in the gastrointestinal tract of birds. For this propose, Aspergillus niger phytase was produced on PSM media and Escherichia coli and Bacillus subtilis phytases with using recombinant protein technology. The enzymes were purified by Q-Sepharose and Ni-NTA chromatography column and, using SDS-PAGE, their molecular weights were estimated 42 kDa, 44 kDa and 66 kDa for PhyC) Alkaline Phytase ( , appA (Escherichia coli Phytase) and PhyA) Acid Phytase ( respectively. The phytase activity for phyC, appA and phyA were determined 54.81, 35.49 and 29.33 U/ml, respectively. Comapring their kinetics parameters, it was shown that phyC enzyme can be active in 90 0C and had thermostability while appA enzyme had best rang of activity in pH of 4-4.5 and efficient enzyme in gastrointestinal tract and appA had maximum affinity to substrate by km 0.09±0.03. According to the results, a suitable combination of these enzymes could be efficient enough to hydrolyse phytate in gastrointestinal tract of birds.