بررسي عملكرد برون تني ريزبافت‌هاي كبدي توليد شده با روش هم‌كشتي سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي، اندوتليالي و رده كبدي

Investigation of in vitro Functionality of Liver Microtissues Produced by Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells, Endothelial, and Hepatic Cell Line

سابقه و هدف: امروزه نياز روزافزوني به مدل­هاي آزمايشگاهي كبدي بهمنظور بررسي مكانيسم بيماري هاي انسان، اثربخشي داروهاي جديد و سم شناسي وجود دارد. مطالعات پيشين نشان دادهاند كه هم­كشتي هپاتوسيت­ها با سلول­هاي غيرپارانشيمي و حضور ماتريكس برون­سلولي، بهويژه در شرايط كشت سه­بعدي، مي­تواند موجب بهبود عملكرد هپاتوسيت­ها شود. لذا هدف اين مطالعه ايجاد يك روش تكرارپذير و مقرون­به­صرفه براي توليد انبوه ريزبافت­هاي كبدي در شرايط آزمايشگاهي بود. مواد و روش­ها: در اين مطالعه تجربي، ريزبافت­هاي كبدي (با قطر 500 ميكرومتر) با هم­كشتي سلول­هاي بنيادي مزانشيمي انسان، سلول­هاي اندوتليالي وريد بندناف انسان و سلول­هاي رده­ي كبديHuh-7، در يك بستر هيدروژليِ حاصل از ماتريكس برونسلولي كبد و آلژينات، توليد ­شدند. سپس زنده ماني سلولها، قابليت ذخيره گليكوژن و فعاليت آنزيم سيتوكروم P450 آنها در روز 28 ارزيابي شد. بيان ژنهاي اختصاصي كبدي (ALB, SULT1A1) در روز هاي 1 و 14، و ميزان ترشح آلبومين و اوره در روزهاي 1، 7، 14، 21 و 28 بررسي گرديد. علاوهبرآن، حساسيت ريزبافتها به سمّيت حاد دارويي ناشي از متفورمين و ديكلوفناك، و همچنين اتانول مورد ارزيابي قرار گرفت. كشت دوبعدي سلول هاي Huh-7 نيز به عنوان گروه كنترل لحاظ گرديد. يافته ­ها: اكثر سلولهاي ريزبافت ها تا روز 28 زنده بوده و ضمن ذخيره سازي گليكوژن، قابليت القاءپذيري سيتوكروم را تا 7 برابر فعاليت پايه داشتند. بيان ژنهاي ALB و SULT1A1 در ريزبافتها، در روز 14 نسبت به گروه كنترل افزايش معني داري (p<0.05) يافته بود. ترشح آلبومين و اوره نيز در همه زمانهاي نمونه برداري، در ريزبافتهاي كبدي بطور معني داري (p<0.05) بالاتر از گروه كنترل بود. علاوه برآن، ريزبافتهاي كبدي نسبت به گروه كنترل، به سمّيت دارويي و الكل (در برخي غلظت ها) حساسيت بيشتري (p<0.05) را نشان مي دادند. نتيجه­ گيري: به نظر مي رسد كه ريزبافتهاي كبدي حاصله مي­ توانند به­ عنوان مدل آزمايشگاهي مناسب و داراي عملكرد براي كبد درنظر گرفته شود.

Background: There is an urgent need for reliable in vitro liver models to assess the mechanisms of human diseases, and impact of newly developed drugs or toxins. It was previously shown that co-culture of hepatocytes with non-parenchymal cells and presence of extracellular matrix (ECM) improve the in vitro functionality of hepatocytes. The aim of the present study was to develop a reproducible method for scalable generation of liver microtissues. Materials and Methods: In the current experimental study, liver microtissues with 500 um diameter were generated through co-culturing of Huh-7, human mesenchymal stem cells, and human umbilical vein endothelial cells in a composite hydrogel of liver-ECM and alginate. Cell viability, capability for glycogen storage, and cytochrome P450 enzyme activity were evaluated on day 28. Hepatic-specific genes (ALB and SULT1A1) on days 1 and 14, and albumin and urea secretion on days 1 ,7 ,14 ,21, and 28 were assessed. Furthermore, the microtissue sensitivity to acute toxicity of Metformin, Diclofenac, and ethanol were investigated. Two-dimensional cultured Huh-7 was considered as control group. Results: Most cells in the microtissues were alive up to day 28 and along with accumulation of glycogen, had cytochrome inducibility 7-fold more than the basic activity. In comparison to controls, ALB and SULT1A1 genes upregulated (p<0.05) on day 14. Also, albumin and urea secretion increased (p<0.05) in all sampling time in microtissues. Furthermore, microtissues had more sensitivity (p<0.05) to some concentrations of the drugs and ethanol, compared to the controls. Conclusion: It seems that the liver microtissues may be considered as an appropriate and functional in vitro model for liver.