پديد آورندگان :
هاشمي، منا دانشگاه علوم كشاورزي و منابع طبيعي ساري - دانشكده علوم دامي و شيلات - گروه ژنتيك و اصلاح نژاد دام , رحيمي ميانجي، قدرت دانشگاه علوم كشاورزي و منابع طبيعي ساري - دانشكده علوم دامي و شيلات - گروه ژنتيك و اصلاح نژاد دام , بنابازي، محمدحسين سازمان تحقيقات،آموزش و ترويج كشاورزي، كرج، ايران - موسسه تحقيقات علوم دامي كشور - بخش پژوهش‌هاي بيوتكنولوژي , بيسكاريني، فيليپو شوراي تحقيقات ملي (CNR) ايتاليا , اوروزكو ترونگل، پابلو دانشگاه كارديف، ولز
كليدواژه :
تنوع ژنتيكي , موتيف هاي ريزماهواره ايي , نشانگرهاي ريزماهواره , گوسفند
چكيده فارسي :
سابقه و هدف
ريزماهواره‌ها نواحي تكراري در دي.ان.آشامل آرايه‌هاي همگني از موتيف‌هاي مونو، دي، تري، تترا، پنتا و هگزا نوكلئوتيدي با طول كمتر از يك كيلو جفت باز هستند كه به صورت غير تصادفي در سطح ژنوم پراكنده‌اند. تعداد و تراكم ريزماهواره‌ها در گونه‌هاي مختلف متفاوت است. حتي در گونه هاي بسيار نزديك به هم مثل انسان و شامپانزه نيز تفاوت هايي وجود دارد. فراواني موتيف‌هاي ريزماهواره‌ايي نيز در موجودات مختلف، متفاوت و داراي نرخ جهش متفاوتي مي‌باشند. در ژنوم پستانداران، ريزماهواره‌هاي دي نوكلئوتيدي فراوانترين و پس از آنها ريزماهواره هاي مونو و تترا نوكلئوتيدي از وفور بالايي برخوردارند. تكرارهاي تري نوكلئوتيدي معمولاً در گياهان فراوان‌تر هستند. اما بررسي اثراين موتيف‌هاي ريزماهواره‌اي متفاوت روي برآورد پارامترهاي تنوع ژنتيكي و يا ساختار ژنتيكي در جمعيت‌ها بحثي است كه كمتر به آن توجه شده است.
مواد و روش‌ها
اين پژوهش با استفاده از فايل نشانگرهاي ريزماهواره‌اي حاصل از 36 نمونه از گوسفندان اهلي و وحشي ايراني از توالي كل ژنوم گوسفندان به روش توالي يابي نسل جديد، تعداد 163973 نشانگر ريزماهواره را شناسايي شد. پراكنش نمونه هاي اهلي مربوط به نواحي شمال غرب كشور و نمونه هاي وحشي مربوط به نواحي مركزي و شمال غرب كشور مي باشند. پس از طي مراحل مختلف جهت مرتب سازي و فيلتراسيون جايگاه‌ها در نرم افزارهاي Samtools و VCFtools نشانگرها در چهار فايل جداگانه شامل نشانگرهاي دي، تري و تترا نوكلئوتيدي و نيز فايلي حاوي تركيبي از هرسه نشانگر دسته بندي شدند. سپس اسكريپتي در نرم افزار R جهت تهيه زيرمجموعه‌هاي مختلفي شامل10، 20، 30، 40، 50، 60، 70، 80، 90، 100، 150، 200، 250، 300، 400 و 500 نشانگر از هر يك از انواع موتيف‌ها تهيه نوشته شد و شش پارامتر معمول مورد استفاده در مطالعات تنوع ژنتيكي از جمله هتروزيگوسيته مشاهده شده، هتروزيگوسيته مورد انتظار، شاخص تنوع ئني، شاخص شانون، غناي آللي و ضريب همخوني با استفاده از هر يك از انواع موتيف‌ها و تعداد مختلفي از ريزماهواره‌ها در نرم افزار MSA (نسخه 4.05) محاسبه شد. براي هر پارامتر 10 تكرار در نظر گرفته شد. در نهايت ميانگين و واريانس هر پارامتر در بين 10 تكرار محاسبه و نتايج به صورت نمودارهاي باكس پلات در نرم افزار R (نسخه 3.3.3 ) گزارش شد. براي بررسي آماري اختلاف‌هايي كه در مقدار برآورد پارامترهاي مختلف با استفاده از تعداد و انواع مختلف موتيف‌هاي ريزماهواره‌اي مشاهده شد، از روش تحليل واريانس براي آزمون فرض مقايسه ميانگين زيرمجموعه‌هاي مختلف در نرم افزار R استفاده شد.
يافته‌ها
برآورد شش پارامتر با استفاده از تعداد و موتيف‌هاي مختلف نشانگرهاي ريزماهواره‌ايي نتايج متفاوتي را نشان دادند. به طوريكه در هر زير مجموعه، پارامتر برآورده شده با استفاده از موتيف‌هاي نوع دي مقدار عددي بالاتري را به خود اختصاص داد. همينطور در اكثر پارامترهاي مورد بررسي بيشترين مقدار برآورده شده براي آن پارامتر با استفاده از 40 نشانگر دي نوكلئوتيدي و كمترين آن با استفاده از 10 نشانگر تري و يا تترا نوكلئوتيدي به دست آمده است. براي بررسي وجود اختلاف معني دار در نتايج به دست آمده از برآورد پارامترها با استفاده از تعداد و انواع مختلف موتيف‌هاي ريزماهواره‌اي از تكنيك آناليز واريانس براي مقايسه ميانگين‌ها استفاده شد. در مواردي كه اجراي مدل نتايج معني داري نشان داد به منظور بررسي دوبه‌دوي زيرمجموعه‌هايي كه با يكديگر اختلاف معني دار نشان دادند از روش مقايسه ميانگين توكي استفاده شد.
نتيجه گيري
نتايج اين پژوهش برتري استفاده از موتيف هاي نوع دي نوكلئوتيدي در مطالعات تنوع ژنتيكي بر جمعيت گوسفند را نشان داد. همينطور نتايج اين پژوهش لزوم استفاده از حداقل 50 جايگاه ريزماهوره‌اي را براي داشتن برآوردهايي باثبات از پارامترهاي جمعيتي در مطالعات تنوع ژنتيكي پيشنهاد ميدهد
چكيده لاتين :
Background and objective:
Microsatellites are repetitive regions in DNA including homogeneous array of mono, di, tri, tetra, penta and hexa nucleotides with length of less than 1 Kbp which are non-randomly distributed in genome. The number and density of microsatellites is vary within species even in very close spices such as humans and chimpanzees. The frequency of microsatellite motifs and their mutation rate is reported differently in various organisms. In mammalian genomes di-nucleotide microsatellites are the more abundant type following by mono and tetra microsatellite motifs as next. Tri microsatellites are more frequent in plants. However, the effect of variety in microsatellite motifs on genetic diversity or population structural parameters is a topic that has received less attention.
Material and methods
In the present study with using the 36 VCf file of microsatellite markers extracted from whole genome of Iranian sheep “Ovis aries and Ovis orientalis” by NGS, the total number of 163973 microsatellite markers were detected. The distribution of Ovis aries samples is from north-west part of Iran and ovis orientalis samples are belongs to central part and north-west of Iran. After rearrangement and filtration on data file using Samtools and VCFtools softwares, we classified the whole markers on four different motif types including di- tri- and tetra-nucleotide microsatellites and a file includes all three microsatellite types. Several subsets including 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 and 500 markers were generated from each microsatellite motif types using a R script. Six common genetic diversity parameters including observed and expected heterozygosity, Nei diversity index, Shanon index, Allelic richness and FIS were calculated for each different subset of number and motif type of microsatellites in MSA (V.4.05) software. 10 replications were considered for each parameter. The mean and variance were calculated among 10 replications and results were represented by boxplots using R (v.3.3.3). The statistical investigation of parameter estimation differences using different microsatellite number and motif types were analyzed using ANOVA for testing the hypothesis of equality of means in R (v.3.3.3).
Results
Estimation of all six parameters revealed various results using different number of loci as well as motif types. Additionally, the results revealed higher values for parameters estimated with di microsatellite motifs compared to others. In addition, the highest and lowest value for most parameters were obtained by 40-di and 10-tri/tetra microsatellites respectively. The statistical significance on findings of parameter values using different number/motif of microsatellite markers were analyzed using ANOVA in R (v.3.3.3). In the case with significant results, Tukey Honestly Significant Difference test was used to test pairwise contrasts between different subsets.
Conclusion
Our result proposes a better application of di microsatellites for genetic diversity studies in sheep populations. Moreover, results showed that for stable estimation of population parameters in genetic diversity studies a minimum of 50 microsatellite loci are needed.
