كلون‌كردن ژن survivin انساني در وكتور پروكاريوتي pET-28a و ارزيابي بيان پروتئين در باكتري E.coli BL21 (DE3)

Cloning of Human Survivin in pET-28a and its Protein Expression Study in E. coli BL21(DE3

مهاركننده آپوپتوز (IAP) يك خانواده از پروتيين ها هستند كه با مهار فعاليت كاسپاز مرگ سلول را متوقف مي كنند. Survivin كوچكترين پروتيين شناخته شده از اين خانواده است كه در سلول هاي سرطاني مشاهده مي شود اما در بافت هاي نرمال بجز بافت جنيني مشاهده نشده است. survivin ممكن است به عنوان يك ماركر جديد براي شناسايي و درمان سرطان مورد استفاده قرار گيرد. هدف از اين پژوهش، كلونينگ ژن survivin در وكتور pET-28a و بيان پروتيين در باكتري E.coli بود. ژن survivin با روش PCR و با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي و الگوي pcDNA-survivin تكثير شد. محصول PCR و پلاسميد pET-28a با آنزيم هاي محدودگر HindIII/NheIبرش داده و survivin درون وكتور برش خورده الحاق شد. سپس محصول الحاق شده به باكتري E.coli DH5a ترنسفورم و با استفاده از آنتي بيوتيك كانامايسين غربالگري شد. كلوني ها با روش PCR ارزيابي شده و پلاسميد كلوني مثبت با روش هضم دوگانه غربالگري شده، در نهايت يك كلوني مثبت با تعيين توالي تاييد شد. پلاسميد نوتركيب با روش شيميايي به باكتري بياني E.coli (BL21) ترنسفورم شد. بيان survivin در شرايط مختلف انجام و سطح بيان با SDS-PAGE بررسي شد.ﯾﺎﻓﺘﻪﻫﺎ: اﻧﺪازه ﻗﻄﻌﻪ ﺗﮑﺜﯿﺮﺷﺪه ﺗﻮﺳﻂ PCR ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از ژل آﮔﺎرز ﺗﺎﯾﯿﺪ ﺷﺪ. ﭘﻼﺳﻤﯿﺪ pET-28a ﺑﺮشﺧﻮرده ﻧﯿﺰ ﻓﻌﺎﻟﯿﺖ آﻧﺰﯾﻤﯽ را ﺗﺎﯾﯿﺪ ﮐﺮد. ﻗﻄﻌﻪ ﮐﻠﻮنﺷﺪه ﭘﺲ از ﺗﻮاﻟﯽﯾﺎﺑﯽ ﺗﺸﺎﺑﻪ 100% ﺑﺎ ﺳﻮروﯾﻮﯾﻦ اﻧﺴﺎﻧﯽ داﺷﺖ. اﻓﺰودن IPTG ﻣﻮﺟﺐ ﺑﯿﺎن ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ ﺳﻮروﯾﻮﯾﻦ در ﺗﻤﺎم ﺷﺮاﯾﻂ ﺧﺼﻮﺻﺎً دﻣﺎي 37˚C از زﻣﺎن 2 ﺳﺎﻋﺖ ﭘﺲ از اﻟﻘﺎ ﺷﺪ اﻣﺎ در ﻫﻤﻪ ﺷﺮاﯾﻂ، ﻋﻤﺪه ﺳﻮروﯾﻮﯾﻦ ﺑﯿﺎنﺷﺪه در ﺑﺎﮐﺘﺮي ﺑﻪﺻﻮرت ﺗﺠﻤﻌﯽ ﺑﻮد. ﻧﺘﯿﺠﻪﮔﯿﺮي: ژن ﺳﻮروﯾﻮﯾﻦ ﻧﻮع وﺣﺸﯽ در ﭘﻼﺳﻤﯿﺪ pET-28a ﮐﻠﻮن ﺷﺪ و ﺑﯿﺎن آن درون E. coli (BL21) ﺑﻪﺻﻮرت ﻧﺎﻣﺤﻠﻮل ﻫﻤﺮاه ﺑﺎ ﻣﺤﻠﻮل ﺑﻮد. ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ ﺣﺎﺿﺮ راﻫﮑﺎر ﺗﻮﻟﯿﺪ اﯾﻦ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ را در ﺑﺎﮐﺘﺮ ي E. coli اراﯾﻪ داد.

The Inhibitors of apoptosis proteins (IAPs) are a family of proteins that block cell death through caspase activity. Survivin is the smallest IAPs family member that overexpresses in different cancer types but not in normal tissue except embryonic tissue. Survivin may be used as a new marker to stratify cancer patients for more optimal treatment modalities. The aim of the current study was to investigate survivin DNA cloning into pET-28a and its expression in E. coli. Materials & Methods The sequence of survivin gene was amplified by PCR using specific primers and pcDNA-survivin pattern. PCR product and pET-28a plasmid were digested by HindIII/NheI restriction enzymes and survivin was ligated into the digested vector. Then, the ligation product was transformed into the E. coli DH5a competent cells and screened by antibiotic selection marker (kanamycin). Positive colonies were selected by colony PCR and screened by double digestion of isolated plasmid. One positive colony was sequenced and confirmed. The recombinant plasmid was transformed into the expression strain of E. coli (BL21) by chemical method. The expression of survivin was induced in the different conditions and expression levels investigated by SDS-PAGE. Findings The size of PCR product in agarose gel showed the correctness of amplification. The digested pET-28a plasmid also indicated the correctness of enzymatic reaction. The sequence of the cloned fragment revealed a 100% similarity to the human survivin. In expressing, adding IPTG increased the expression of survivin protein in all conditions, especially 37ᵒC from 2h after induction. At all conditions, most of survivin accumulated in the bacteria as inclusion body. Conclusion The wild type survivin gene was cloned into the pET-28a plasmid and the expression of survivin into the expression strain of E. coli (BL21) was as in-soluble form mixed soluble. The present study paves the way for producing this protein in E. coli.