مطالعه اثر تيتانيوم كربيد مورد استفاده در ايمپلنت‌ها بر نشانگرهاي بياني بنيادينگي و پيري سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي مشتق شده از مغز استخوان موش

The effect of titanium carbide used in implants on stemness and senescence of mouse bone marrow derived mesenchymal stem cells

زمينه: هدف از اين كار پژوهشي تعيين اثر نانوذرات تيتانيوم كربيد بر نشانگرهاي بياني بنيادينگي و پيري سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي مشتق شده از مغز استخوان موش مي‌باشد. روش‌كار: پس از استخراج سلول‌هاي بنيادي مغز استخوان، ماركرهاي آنها به كمك فلوسايتومتري مطالعه شد. آزمون سميتMTT براي سلول‌هاي بنيادي مغز استخوان موش كشت شده در مجاورت تيتانيوم كربيد انجام شد. سپس چرخه سلولي به كمك فلوسايتومتري، تشكيل كلني به كمك تست بررسي تشكيل كلني و پيري از طريق رنگ‌آميزي بتاگالاكتوزيداز پس از مجاورت دادن سلول‌ها با تيتانيوم كربيد انجام شد. در نهايت بيان ژن‌هاي بنيادينگي Nanog, OCT4 به كمك QRT-PCR مطالعه شد. يافته‌ها: سلول‌هاي بنيادي مغز استخوان موش به خوبي استخراج و به شكل دوكي بودند. مطالعه ماركرهاي سطحي با كمك تكنيك فلوسايتومتري، هويت سلول‌هاي بنيادي اين مطالعه را مورد تاييد قرارداد (ماركرهاي سطح سلول 45CD ،44CD،90CD،11CD). نتايج آزمون MTT نشان داد كه تيتانيوم كربيد در كوتاه‌مدت سميت نشان نمي‌دهد اما در مدت زمان 3 و 6 روز پس از انكوباسيون سلول‌هاي مغز استخوان موش با دوزهاي 1/0 الي 1 ميلي‌مولار، سميت وابسته به دوز و زمان نشان داد (p<0.05). همچنين نتايج چرخه سلولي نشان داد كه نسبت به گروه كنترل، سلول‌هاي بيشتري وارد فاز G0/G1 شده و جمعيت سلول‌ها در فاز S كاهش نشان مي‌دهند. نتايج تشكيل كلوني نشان داد كه سلول‌هاي در معرض تيتانيوم كربيد نسبت به گروه كنترل كلوني‌هاي با اندازه كوچك‌تري تشكيل مي‌دهند. همچنين رنگ‌آميزي بتاگالاكتوزيداز نشان داد كه درسلول‌هاي در معرض تيتانيوم كربيد تعداد سلول‌هاي بيشتري رنگ‌آميزي مثبت نشان مي‌دهند. نتايجqPCR همچنين نشان دهنده كاهش بيان ژن‌هاي بنيادينگي شاملNanog ،4- OCTنسبت به كنترل بود. سلول‌هاي بنيادي مغز استخوان جزو سلول‌هايي هستند كه به احتمال زياد در معرض مواد ايمپلنت‌ها و مواد‌ آزاد شده از آنها قرار مي‌گيرند، بنابراين مطالعه اثر اين مواد در طولاني‌مدت بروي بنيادينگي و پيري سلول‌هاي بنيادي مغز استخوان مي‌تواند براي مديريت خطرات احتمالي اين مواد مفيد باشد. در اين مطالعه اثر تيتانيوم كربيد بر سلول‌هاي بنيادي موش مورد مطالعه قرار گرفت و نتايج اين مطالعه با مطالعات قبلي كه روي مشتقات ديگر تيتانيوم انجام شده است سازگار و نزديك بود. نتيجه‌گيري: با توجه به يافته‌هاي اين تحقيق تيتانيوم كربيد به عنوان يك ماده مورد استفاده در ايمپلنت در طولاني مدت مي‌تواند اثرات منفي بر زنده ماني سلول‌ها ي بنيادي مغز استخوان رت و بنيادينگي آنها داشته همچنين پيري درآنها را افزايش دهد.

Background: The aim of the present study was to determine the effect of Titanium carbide nanoparticles on stemness and senescence markers of mouse bone marrow derived mesenchymal stem cells. Methods: After isolation of mesenchymal stem cells from mouse’s bone marrow, their surface markers were studied using flowcytometry. MTT assay, cell cycle analysis; colony forming assay, and senescent beta galactosidase staining were performed for cells treated with titanium carbide nanoparticles. Then, the expression of OCT-4 and Nanog genes were studied by qRT-PCR in titanium carbide treated mouse’s bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs). Results: All mBMSCs showed spindle shaped morphology. Their identity was confirmed by flow cytometry of stained cells for CD11b, CD90, CD45, and CD44 markers. The MTT assay results showed that titanium carbide effect is time-dependent and no cytotoxic effects were observed in short treatment times. But toxic effects were observed after 72 or 144 hours of post treatment with doses range from 0.1 to 1 mM (P<0.05). Besides, cell cycle study detected more cell populations in G0/G1 and less percentage in S phase. The colony forming assay in treated cells exhibited smaller size of colonies. The beta galactosidase staining of treated cells demonstrated more positive cells (more aged cells). Finally, qRT-PCR showed significant down regulation of OCT-4 and Nanog (p<0.05). Conclusion: Titanium carbide as an implant material could affect the viability, stemness and senescence of mBMSCs in negative manner.