كلونينگ و بيان پلي پپتيد نوتركيب HPV16 / 18 L1-L2-E7 در سيستم بياني باكتري

Cloning and Expression of the Recombinant HPV16/18 L1-L2-E7 Polypeptide in Bacterial Expression System

سابقه و هدف: ويروس هاي پاپيلوماي انساني (HPV) به ويژه انواع 16 و 18 مهمترين عامل سرطان دهانه رحم محسوب مي شوند كه شايع ترين آنها، دو نوع 16 و 18 هستند. از بين انواع پروتئين هاي مرتبط با HPV، پروتئين هاي كپسيدي L1 و L2 و نيز انكوپروتئين E7 به عنوان آنتي ژن هاي هدف براي طراحي واكسن مطرح مي باشند. در سالهاي اخير، واكسن هاي نوتركيب پلي پپتيدي چند اپي توپي مورد توجه قرار گرفته اند. هدف از اين مطالعه طراحي سازه فيوژني L1-L2-E7 و ارزيابي بيان آن در سيستم بياني باكتري است. مواد و روش ها: در اين مطالعه، با استفاده از آناليزهاي بيوانفورماتيكي مختلف، اپي توپ هاي ايمنوژنيك و حفاظت شده از پروتئين هاي L1، L2 و E7 ويروس هاي پاپيلوماي انساني نوع 16 و 18 انتخاب شدند. پس از سنتز توالي فيوژن طراحي شده L1-L2-E7 در وكتور كلونينگ pUC57، ساب كلون كردن آن در وكتور بيان پروكاريوتي pET24a(+) توسط آنزيم هاي محدودالاثر EcoRI/ HindIII انجام شد. بيان پلي پپتيد چند اپي توپي نوتركيب در سويه باكتري E.coli Rosetta توسط القاگر IPTG انجام و تأييد آن توسط آناليزهاي SDS-PAGE و وسترن بلات با استفاده از آنتي بادي ضد دنباله هيستيديني صورت گرفت. بهينه سازي بيان تحت شرايط مختلف جذب (در طول موج 600 نانومتر)، دما و زمان پس از القا و غلظت IPTG انجام شد. يافته ها: ساب كلون كردن سازه ژني L1-L2-E7 در وكتور pET توسط حضور باند حدود 525 جفت باز روي ژل آگارز بعد از هضم آنزيمي تأييد شد. نتيجه بيان پلي پپتيدL1-L2-E7 در باكتري، حضور باند حدود 20 كيلودالتون را روي ژل SDS-PAGE و وسترن بلات آشكار كرد. بهترين شرايط براي بيان پلي پپتيد نوتركيب در دماي 37 درجه، جذب حدود 0/7 تا 0/8، غلظت IPTG يك ميلي مولار و زمان 16 ساعت پس از القا بود. نتيجه گيري: بيان موفق سازه پلي پپتيد چند اپي توپي L1-L2-E7 در سيستم باكتري انجام شد. تخليص پلي پپتيد نوتركيب به عنوان كانديد واكسن در مراحل بعدي صورت خواهد گرفت.

Aim and Background: Human papillomaviruses (HPVs) especially types 16 and 18 are known as the major causes of cervical cancer. Among HPV proteins, L1 and L2 capsid proteins, and also E7 oncoprotein are proposed as target antigens for vaccine design. In the recent years, the recombinant multiepitope polypeptides have attracted a special interest. The goal of this study is the design of L1-L2-E7 fusion construct and evaluation of its expression in bacterial expression system. Materials and Methods: In this study, the immunogenic and conserved epitopes of HPV16/18 L1, L2 and E7 proteins were selected using different bioinformatics analyses. After synthesis of the designed L1-L2-E7 fusion sequence in pUC57 cloning vector, its subcloning was performed in pET24a (+) prokaryotic expression vector using EcoRI/ HindIII restriction enzymes. The expression of the recombinant multiepitope polypeptide was done in E.coli Rosetta strain using IPTG inducer, and confirmed by SDS-PAGE and western blotting using anti-His-tag antibody. The expression was optimized under different conditions such as optical density (OD in wavelength of 600 nm), temperature and time after induction, and IPTG concentration. Results: The recombinant pET-L1-L2-E7 vector was confirmed by the presence of a clear band (~525 bp) related to the L1-L2-E7 gene on agarose gel after enzyme digestion. The expression of L1-L2-E7 polypeptide in bacteria showed the presence of a clear band (~20 kDa) in SDS-PAGE and western blotting. The best conditions for expression of the recombinant polypeptide were at temperature of 37◦C, optical density of 0.7-0.8, IPTG concentration of 1mM, and time of 16 h after induction. Conclusion: The successful expression of the L1-L2-E7 multiepitope polypeptide was performed in bacterial system. In the next step, the recombinant polypeptide will be purified to use as a vaccine candidate.