شرايط بهينه در استخراج و خالص سازي آنزيم پني سيليناز

Optimal Conditions for Extraction and Purification of Penicillinase Enzyme

مطالعه حاضر با هدف بررسي شرايط بهينه براي استخراج و خالص سازي آنزيم پني سيليناز انجام شد. منبع آنزيم، با كتري 6346Bacillus licheniformis بدست آمده سازمان پژوهش هاي علمي - صنعتي ايران بود. مواد و روش كار باكتري B. licheniformisدر محيطي حاوي نمك هاي معدني، تركيبات نيتروژن دار و منابع كربني كشت داده شد. بعد از برداشت و آماده سازي سوسپانسيون باكتري، تخريب ديواره سلولي باكتري به روش تلفيقي از ليزوزيم و اولتراسونيكاسيون ضعيف جهت تهيه عصاره خام سلولي، صورت گرفت. سپس با روش كروماتوگرافي و الكتروفورز مقدار آنزيم تعيين شد. علاوه بر اين، بهترين دماي رشد و بهترين زمان انكوباسيون بر اساس ميزان جذب نمونه ها در طول موج 240 نانومتر، ميزان فعاليت آنزيمي ، بهينه سازي شدت هوادهي، بهينه سازي زمان توليد آنزيم و pH بهينه مشخص شد. يافته ها در هر ليتر كشت حدود 8 گرم سلول بازيابي شد. pH بهينه 6/5 تعيين گرديد. ارزيابي پايداري حرارتي آنزيم در زمان هاي مختلف نشان داد كه، آنزيم براي بيش از 1 ساعت در دماي 20 تا 45 درجه سانتي گراد پايدار است، در حالي كه در 60 درجه سانتي گراد در 10 دقيقه غيرفعال مي شود. همچنين بهترين زمان انكوباسيون براي باكتري 9 ساعت در دماي 30 درجه سانتي گراد است. همچنين از لحاظ شدت هوا دهي بالاترين ميزان توليد آنزيم در ارلن هاي 250 ميلي ليتري با حجم 50 ميلي ليتر محيط كشت، در دورRPM 200، به دست آمد. ميزان توليد آنزيم در اين شرايط به unit/ml 2394 رسيد، هوا دهي بيشتر باعث اثر مهار كنندگي اكسيژن و كاهش فعاليت آنزيم توليد شده، گرديد. نتيجه گيري باكتري B. licheniformis ميكروارگانيسم مناسبي براي استخراج آنريم پني سيليناز است.

The present study aimed to evaluate the optimum conditions for extracting and purifying penicillinase enzyme. The enzyme source was Bacillus licheniformis 6346 obtained from the Iranian Research Organization for Science and Technology. Materials and Methods B. licheniformis was cultured in a medium containing mineral salts, nitrogen compounds, and cultured carbon sources. Following the harvesting and preparation of bacterial suspension, the destruction of the bacterial cell wall and crude cell extraction was completed using a combination of lysozyme and weak ultrasonication. Afterward, enzyme amount was determined utilizing chromatography and electrophoresis. Furthermore, the optimum growth temperature and incubation time were assessed based on the absorbance of samples at 240 nm, enzyme activity, aerification intensity optimization, enzyme production time, and optimum pH. Results Approximately 8 g of cells were retrieved in one liter of culture. The optimum pH was determined as 6.8. The heat stability evaluation of the enzyme at different times revealed that the enzyme was stable for more than 1 h at 20°C-45°C, while it is inactivated in 10 min at 60°C. Moreover, the best incubation time for this bacterium was obtained as 9 h at 30°C. In terms of aerification intensity, the highest enzyme production rate of 2394 U/mL was achieved in a 250 mL Erlenmeyer flask with a 50 mL culture medium at 200 RPM. More aerification led to the inhibitory effect of oxygen and reduced enzyme activity. Conclusion Our findings showed that the bacterium B. licheniformis 6346 can be used for producing penicillinase enzyme in optimum conditions.