بررسي پايداري بيان پروتئين غشاي سطحي Lipl41به صورت فيوژن با پروتئين كوچك چاپرون Lepدر لپتوسپيرا

The Evaluation of the Stability of Lipl41 Outer Membrane Protein Expression in Fusion with Lep, a Small Chaperone Protein, inLeptospira

زمينه و هدف: لپتوسپيروزيس يك بيماري باكتريايي مشترك بين انسان و دام با انتشار جهاني مي‌باشد كه توسط اسپيروكت بيماريزايي به نام لپتوسپيرا ايجاد مي‌گردد. متاسفانه تشخيص ­اين بيماري بدليل علائم متعدد باليني بسيار مشكل و داراي محدوديت است. LipL41 يكي از فراوان­ترين پروتئين­ هاي غشاي خارجي لپتوسپيرا ست كه فقط در سويه هاي بيماري زا وجود دارد. ژن كوچكي بنام lep در فاصله بسيار نزديك با ژن lipl41 بر روي كروموزوم باكتري قرار دارد كه كمك كننده بيان آن مي‌باشد. در اين مطالعه براي اولين بار بررسي بيان و تخليص پروتئين فيوژن Lipl41-Lep بر روي سويه هاي بومي رايج لپتوسپيراي بيماري زا در سيستم پروكاريوتي صورت گرفت. مواد و روش ها: توالي ژني بر مبناي الگوي سرووارهاي ايران پس از جمع آوري كليه اطلاعات موجود در سايتNCBI طراحي و ساخته شد. سپس با كلونينگ در وكتوربياني pET32a+ در E.coliBL21(DE3) انتقال و توسط القاء كننده IPTG بيان انجام شد. پس از ليز سلولي با روش دناتوراسيون خالص سازي صورت گرفت. روش وسترن بلات براي تاييد حضور پروتئين فيوژن نوتركيب استفاده گرديد. يافته‌ها :نتايج آناليز PCR وجود باند واضح حدود 2000 جفت باز را روي ژل آگارز تأييد كرد. مقادير زيادي از پروتئين فيوژن نوتركيب 60 كيلودالتوني در دماي ˚C37‌‌، با غلظت mM0/1 از IPTG و زمان 4 ساعت پس از القا به صورت نامحلول توليد، استخراج و خالص سازي شد. نتيجه گيري:يافته‌ها نشانگر مقدار كافي از بيان و تخليص اين پروتئين نوتركيب بصورت فيوژن بود. بنابراين از آن مي‌توان در آينده بعنوان كانديداي مناسبي در جهت تستهاي تشخيص سرولوژيك مانند الايزا و همچنين براي واكسن هاي نوتركيب بر عليه لپتوسپيروز استفاده شود.

Aim and objective:Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic spirochete called Leptospira that has worldwide distribution. Unfortunately, due to the variety of clinical symptoms, its diagnosis has many limitations. LipL41 is among the most abundant outer membrane proteins in Leptospira and is exclusively found in pathogenic species. A small gene called lep is located very close to lipl41 gene on the bacterial chromosome, which facilitates its expression. In this study, the expression and purification of LipL41-Lep fusion protein among prevalent pathogenic isolates in Iran was performed in a prokaryotic system for the first time. Methods:All collected Lipl41 and Lep protein sequences were analyzed from the NCBI database. Complete codon sequences of the pattern of the Iranian serovars were designed and synthesized then sub-cloned into a pET32a+ and transformed into Escherichia coli BL21(DE3) to expression by using IPTG inducer. Thefusion recombinant protein was purified by denaturation and confirmed by western blot. Results:The results of PCR analysis showed a clear band of ~ 2000 bp in Agarose gel. Optimal expression of fusion recombinant protein (60kDa) was achieved post-induction at 4 h at 37 °C in the presence of 0.1 mM IPTG. Then it was purified in the insoluble form. Conclusion:The results demonstrated that adequate amounts of this fusion recombinant protein were expressed andpurified to be used as a fusion antigen in serological testing, such as ELISA, or for the development of subunit vaccines against Leptospirosis in the future.