توليد ايمونوگلوبولين مرغي (IgY) عليه پروتئين نوتركيب LTB از اشرشياكلي انتروتوكسيژنيك ( ETEC) و ارزيابي اثر محافظتي آن در مدل حيواني

Production of Egg Yolk Immunoglobulin (IgY) Against Recombinant LTB of Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) and Evaluation of Its Protective Effect in Animal Model

زمينه و هدف: اشرشياكلي انتروتوكسيژنيك يكي از رايج‌ترين عوامل باكتريايي مولد اسهال در جهان است. از مهم‌ترين فاكتورهاي حدت‌زا ETEC) Enterotoxigenic Escherichia coli)، مي‌توان به زير‌‌ واحد B توكسين حساس به حرارت اشاره كرد كه قسمت اتصالي توكسين را شكل مي‌دهد. در مطالعه پيش رو آنتي‌بادي مرغي عليه پروتئين نوتركيبLymphotoxin Beta (LTB) توليد و اثر محافظتي آن در مدل حيواني مورد آزمايش قرار گرفت. مواد و روش‌ها: 100 ميكروگرم پروتئين نوتركيب LTB به صورت داخل عضلاني به مرغ‌ها تزريق شد. تيتر آنتي‌بادي در سرم مرغ‌ها اندازه‌گيري و تخم‌مرغ‌ها جمع‌آوري و(IgY) Immunoglobulin Y ها از زرده تخم‌مرغ با كمك سديم كلرايد تخليص و تيتر آنتي‌بادي با روش ELISA بررسي شد. توانايي IgY در ممانعت از عملكردLT توكسين بر سلول‌هايY1 در رقت‌هاي متفاوت IgY سنجيده شد. به منظور بررسي اثر باكتري تيمار شده با IgY بر سلول‌هاي اپيتليال روده، از روش استاندارد لوپ ايلئال استفاده گرديد. يافته‌ها: القاء بيان پروتئين منجر به توليد LTB نوتركيب با وزن تقريبي 14 كيلو دالتون شد. غلظت پروتئين تخليص شده 5/4 ميلي‌گرم بر ميلي ليتر بود. با ايمن‌سازي مرغ‌ها تيتر آنتي‌بادي سرمي افزايش يافت. آنتي‌بادي مرغي عليه پروتئين LTB با غلظت 12 ميلي گرم بر ميلي‌ليتر از زرده تخم مرغ تخليص شد. IgY عليه پروتئين نوتركيب LTB در رقت 125 ميكروگرم بر ميلي‌ليتر اثرات توكسين حساس به حرارت LT بر سلول‌هاي Y1 را خنثي كرد. در تست لوپ ايلئال خنثي سازي توكسين با رقت 1/5 ميلي‌گرم بر ميلي‌ليترIgY، مانع از عملكرد توكسين در روده شد. تجمع مايع درون لوپ 74/8درصد در مقايسه با لوپ هاي كنترل كاهش يافت. نتيجه‌گيري: نتايج به دست آمده بيانگر آن است كه مي‌توان از آنتي‌بادي مرغي اختصاصي عليه پروتئين نوتركيب LTB به عنوان آنتي‌بادي پيشگيرانه جهت جلوگيري از عملكرد توكسين حساس به حرارت باكتري ETEC استفاده نمود.

Background and Aim: Enterotoxigenic Escherichia coli is one of the most common bacterial causes of diarrhea worldwide. One of the most important ETEC colonization factors is B subunit of the heat labile enterotoxin, which forms the connecting part of the toxin. In the present study, egg yolk immunoglobulin (IgY) against recombinant LTB protein was produced and its protective effect was evalutated in the animal model. Material and methods: Hens were injected intramuscularly with 100 μg of recombinant LTB protein. Antibody titers of the sera were estimated and the eggs were collected. IgYs were purified from egg yolk and the antibody titers were subsequently estimated by ELISA method. Effecacy of different concentrations of IgY against the effect of LT toxin on Y1 cells was also studied. In order to investigate the effect of IgY-treated bacteria on intestinal epithelial cells we used standard Ileal loop technique. Results: Induction of protein expression led to the production of recombinant LTB with molecular weight of about 14 kDa. Concentration of purified protein was 4.5mg/ml. Immunization of the hens induced serum antibody rise. IgY against LTB was purified from egg yolk at a concentration of 12mg/ml. 125 μg per ml of IgY against LTB prevented the effects of heat labile enterotoxin on Y1. In the Ileal loop test, 1.5 mg / ml of IgY neutralized the toxin effect of LTB on the intestine. Accumulation of fluid in the test loops decreased by 74.8% compared to that in the untreated control loops. Conclusion: The results obtained indicated that specific egg yolk immunoglobulin was effective against recombinant LTB protein and can be used as a preventive antibody to inhibit the heat labile enterotoxin function of ETEC bacteria.