جداسازي، همسانه‌سازي و بيان ژن سرين پروتئاز yyxA استخراج شده از باكتري Bacillus licheniformis در باكتري Escherichia coli

Isolation, Molecular Cloning, and Expression of yyxA Serine Protease Gene Extracted from Bacillus licheniformis in Escherichia coli

هدف: پروتئازها از مهم‌‌‌‌‌‌‌ترين آنزيم‌هاي صنعتي محسوب مي‌شوند. معمولاً براي توليد اين آنزيم‌ها براي مصارف صنعتي از باكتري‌هاي متعلق به جنس باسيلوس استفاده مي‌شود. هدف از اين پژوهش جداسازي، همسانه‌سازي، تعيين توالي، بيان و بررسي بيوانفورماتيكي ژن سرين پروتئاز yyxA استخراج شده از باكتري باسيلوس ليكني‌فورميس بود. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه، پس از استخراج DNA باكتريايي، ژن سرين پروتئاز با نام yyxA از باكتري Bacillus licheniformis با استفاده از تكنيك واكنش زنجيره‌اي پلي‌مراز جداسازي و در ناقل pTG19-T و سپس ناقل pET28a همسانه‌سازي شدند و ساختار مولكولي، ويژگي‌هاي بيوشيميايي و فيلوژنتيكي آن مورد بررسي قرار گرفت. ساختار سه بعدي آنزيم همسانه‌سازي شده با استفاده از ابزارهاي PHYRE2، I-TASSER، RAPTORX و Modeller پيش‌بيني شد. تأييد بيان ژن yyxA توسط آناليز SDS-PAGE و دات بلاتينگ انجام شد. نتايج: درستي همسانه‌سازي به وسيله توالي‌يابي تأييد شد. توليد پروتئين نوتركيب با القاء IPTG به ميزبان حاوي پلاسميد pET28a-yyxA با موفقيت انجام شد. بهينه‌سازي توليد پروتئين نوتركيب مورد بررسي قرار گرفت. بيشترين مقادير بيان در دماي 37 درجه سلسيوس و طي زمان 4 ساعت و با IPTG يك ميلي‌مولار بهدست آمد. نتايج حاصل از بررسي‌هاي فيلوژنتيكي، توالي پروتئيني به دست آمده شباهت زيادي را با توالي‌هاي ساير باسيلوس‌ها از قبيل B. subtilis، B. gobiensis و B. pumilus نشان دادند. پس از ارزيابي مدل‌هاي ترسيم شده مشخص گرديد كه مدل ارائه شده توسط نرم‌افزار PHYRE2 و I-TASSER مدل‌هاي مطلوبي براي پيش‌بيني ساختار سه بعدي اين پروتئاز هستند. نتيجه‌گيري: توالي نوكلئوتيدي ژن yyxA به طول 1212 نوكلئوتيد بوده كه پروتئيني با 403 آمينواسيد را رمز مي‌كند. بررسي‌ها نشان داد كه آنزيم كد شونده توسط اين ژن در دسته آنزيم‌هاي پايدار قرار گرفته و در باكتري اشريشياكلاي به صورت محلول بيان خواهد شد كه اين مزايا موجب مي‌شود كه آنزيم مذكور به عنوان گزينه مناسب براي استفاده در صنعت در نظر گرفته شوند.

Objective Proteases are among the most important industrial enzymes. Microbial proteases, especially from Bacillus sp., are most widely exploited industrially. The aim of this study was isolation, cloning, sequencing, expression, and bioinformatics study of yyxA serine protease gene extracted from Bacillus licheniformis. Materials and methods In this study, after extraction of bacterial DNA, the yyxA serine protease gene was isolated from Bacillus licheniformis using the polymerase chain reaction technique and cloned into the pTG19-T vector. The molecular structure, its biochemical and phylogenetic properties were investigated. The three-dimensional structure of the cloned enzyme was predicted using the I-TASSER, PHYRE2, RAPTORX, and Modeller tools. Confirmation of yyxA gene expression was performed by SDS-PAGE and dot blot analysis. Results Cloning was confirmed by sequencing. Based on the results of phylogenetic studies, the obtained protein sequence showed high similarity to the sequences of other Bacillus species, such as B. subtilis, B. gobiensis, and B. pumilus. After evaluating the drawn models, it was found that the models provided by PHYRE2 and I-TASSER software were desirable ones for predicting the three-dimensional structure of this protease. Recombinant protein production was successfully induced by IPTG induction in the host containing the plasmid pET28a-yyxA. Optimization of recombinant protein production was investigated. The highest expression values were obtained at 37 ° C for 4 hours with one mM IPTG. Conclusions The nucleotide sequence of the yyxA gene is 1212 nucleotides long, encoding a protein with 403 amino acids. Studies have shown that the enzyme encoded by this gene is in the category of stable enzyme and will be expressed in solution in Escherichia coli. These advantages make the enzyme as a suitable candidate for use in industry.