فاكتورهاي تاثيرگذار بر كارايي روش آگرواينجكشن براي بيان سيستميك ژن خارجي در گياه ذرت به‌واسطه ويروس موزائيك نيشكر

Factors influencing the efficiency of an agroinjection-mediated SCMV-based systemic heterologous gene expression system in maize

هدف: ذرت (Zea mays L.) يكي از مهمترين گياهان زراعي در سراسر دنيا و از گياهان مدل خانواده غلات است. استقرار و بهينه‌سازي يك سيستم بيان موقت ژن موفق در ذرت علاوه بر قابليت استفاده در پروژه‌هاي خاموشي ژن يا توليد پروتئين‌هاي نوتركيب، مي‌تواند موجب تسهيل مطالعات عملكرد ژن در اين گياه شود. پژوهش حاضر با هدف بهينه‌سازي سيستم بيان سيستميك ژن به‌واسطه آگروباكتريوم در گياه ذرت با استفاده از يك ناقل مبتني بر ويروس موزائيك نيشكر انجام پذيرفت. مواد و روش‌ها: براي اين منظور از ژنوم ويروسي نوتركيب كه در آن توالي رمزكننده پروتئين فلورسنت سبز (GFP)، در امتداد چهارچوب قرائت آزاد ويروس و در ناحيه بين توالي P1 و HC-Pro ويروس درج شده بود، استفاده شد. براي انتقال ژنوم ويروسي نوتركيب به گياهان ذرت، از روش تزريق مستقيم آگروباكتريومي (آگرواينجكشن) به نواحي مريستمي گره كولئوپتيلي گياهچه استفاده شد. كارايي دو سويه EHA105 و GV3101 باكتري Agrobacterium tumefaciens در انتقال ژنوم نوتركيب ويروس به سه واريته ذرت Iochief، Golden Bantam (ذرت شيرين) و B73 (ذرت دندان اسبي) در دو مرحله رشدي (گياهچه‌هاي سه و هفت روزه) مورد مقايسه قرار گرفت. پس از ظهور علائم موزائيك ويروسي در گياهان تلقيح شده، بيان ژن خارجي GFP با استفاده از ميكروسكوپ فلورسنت كانفوكال و همچنين RT-PCR در اين گياهان در مقايسه با گياهان شاهد ارزيابي شد. نتايج: نتايج حاصل از RT-PCR و ميكروسكوپ فلورسنت كانفوكال، نشان داد كه سويه GV3101 در مقايسه با سويه EHA105 به لحاظ آماري عملكرد بالاتري در انتقال ناقل نوتركيب به گياهان ذرت دارد. همچنين در مقايسه واريته‌هاي مختلف ذرت، اين روش در بيان پروتئين فلورسنت سبز در ذرت واريته گلدن‌بانتام به‌طور بسيار معني‌داري موفق عمل نمود. اگرچه در مورد سويه EHA105 درصد گياهچه‌هاي سه روزه ذرت شيرين گلدن‌بانتام كه به‌طور موفق ناقل محتوي ژن خارجي‌ را دريافت و بيان نمودند بالاتر بود، اما در مورد سويه GV3101 تفاوت معني‌داري ميان گياهچه‌هاي سه و هفت روزه مشاهده نشد. نتيجه‌گيري: ذرت رقم گلدن‌بانتام و آگروباكتريوم سويه GV3101 در مراحل پيش از دوبرگي به‌عنوان يك سيستم مدل بهينه، سريع و كارآمد براي پروژه‌هاي تحقيقاتي بررسي عملكرد ژن و حوزه‌هاي پژوهشي مرتبط پيشنهاد مي‌گردد.

Objective Maize (Zea mays L.) is a key cereal crop throughout the world and important model for plant genetics and biology. Establishment of an efficient transient gene expression system in maize facilitates plant functional genomics projects using gene silencing or heterologous protein overexpression strategies. The present study was aimed at optimizing an Agroinjection-mediated SCMV-based systemic heterologous gene expression system in maize. Materials and methods Recombinant DNA encoding sugarcane mosaic virus (SCMV) containing the coding sequence of green fluorescent protein between the protein 1 (P1) and helper component‐proteinase (HC‐Pro) cistrons, in‐frame with the viral open reading frame, was introduced into the meristematic tissue, above the coleoptilar node, of maize seedlings via a direct Agroinoculation procedure. The efficiency of Agrobacterium tumefaciens strains EHA105 and GV3101 in delivering the recombinant vector into three and seven-day old seedlings of three maize varieties, including sweet corn (Iochief and Golden Bantam varieties) and dent corn (inbred line B73), was examined. Expression of GFP transgene in symptomatic Agroinoculated plants was assessed by confocal fluorescent microscopy and RT-PCR in comparison with controls. Results Results of RT-PCR and confocal fluorescent microscopy revealed that: 1) A. tumefaciens GV3101 is significantly more successful in delivering the recombinant SCMV-based vector into maize plants than EHA105, 2) the percentage of GFP-expressing Golden Bantam plants is significantly higher than two other maize varieties, and 3) The effectiveness of growth stage of maize seedlings on the percentage of GFP expressing Agroinjected plants depends upon the interactions between Agrobacterium strain and maize genotype. Conclusions In conclusion, a combination of the Golden Bantam maize variety and A. tumefaciens strain GV3101 for direct Agroinjection of the SCMV-based vector into seedlings at the early two-leaf stage could be a fast and efficient system for investigating gene functions in maize.