بهينه‌سازي فرايند رفولدينگ ايمونوتوكسين ضد گيرندۀ فاكتور رشد اپيدرمي توليد شده در باكتري اشريشياكلاي

Optimization of the Refolding Process for Recombinant Anti-EGFR Immunotoxin Produced in the Escherichia coli

بيان بيش‌ازحد EGFR با سرطان‌زايي همراه است و در بيش از 70 درصد سرطان‌هاي سر و گردن ديده مي‌شود. بيان ايمونوتوكسين ضد EGFR كه به‌عنوان جايگزيني براي آنتي‌بادي كامل طراحي‌شده است، به توليد پروتئين تجمع‌يافته موسوم به اينكلوژن‌بادي منجر مي‌گردد. هدف از اين مطالعه بررسي دو روش اورۀ 8 مولار و گوانيدين هيدروكلرايد 6 مولار براي به دست آوردن ايمونوتوكسين به‌عنوان فرم محلول و با تاشدگي صحيح بود. مواد و روش ها: سلول‌هاي BL21 (DE3) حاوي وكتور pET28a-huimmunotoxin توسط 1 ميلي‌مولار IPTG در دماي 37 درجۀ سانتي‌گراد به مدت 24 ساعت القا شد و ميزان بيان توسط SDS-PAGE بررسي گرديد. ايمونوتوكسين به‌دست‌آمده كه به‌صورت اينكلوژن‌بادي بود، جداگانه در اورۀ 8 مولار و گوانيدين هيدروكلرايد 6 مولار حل شد و سپس با كروماتوگرافي Ni-NTA خالص گرديد كه به‌صورت تك باند در SDS-PAGE ديده شد. براي ريفولد مناسب ايمونوتوكسين به‌دست‌آمده، نمونه‌هاي حاصل از تخليص در كيسۀ‌‌ دياليز ريخته و طي يك فرايند چندمرحله‌اي موسوم به stepwise dialysis، عوامل دناتوره‌كننده حذف گرديدند. واكنش‌پذيري ايمونوتوكسين تخليص‌شدۀ‌‌ ريفولدشده توسط تكنيك الايزا با استفاده از لايزت سلولي A431 ارزيابي گشت. يافته‌ها: ايمونوتوكسين به مقدار 17mg/ml توسط باكتري به‌صورت اينكلوژن‌بادي بيان شد. ايمونوتوكسين انساني ريفولدشده با سلول‌هاي A431 واكنش‌پذيري بالايي داشت كه نشان‌دهندۀ تاشدگي مناسب ايمونوتوكسين خالص‌شده بود. فعاليت اتصالي 50 درصد ايمونوتوكسين انساني‌شدۀ به‌دست‌آمده از روش‌هاي اوره و گوانيدين هيدروكلرايد، به‌ترتيب 8/0 و 7/1 ميكروگرم بر ميلي‌ليتر بود. بحث و نتيجه‌گيري: نتايج اين مطالعه نشان داد كه روش اوره‌، روش مؤثري در محلول‌سازي و ايجاد فولدينگ مناسب در ايمونوتوكسين‌هايي است كه در باكتري به‌صورت اينكلوژن‌بادي توليد مي‌شوند.

Overexpression of the EGFR is associated with carcinogenesis, and it is observed in more than 70% of head and neck cancers. The expression of an immunotoxin against EGFR designed as an alternative to full antibody led to the production of aggregated protein in the form of inclusion bodies. This study aimed to investigate the 8M urea and 6M guanidine hydrochloride approaches for obtaining the immunotoxin as the soluble and effective form with correct folding. Material & Methods: The BL21 (DE3) cells containing the pET28a-huimmunotoxin construct were induced by 1 mM IPTG at 37°C for 24 h, and the amount of expression was checked by SDS-PAGE. This immunotoxin was in the form of inclusion bodies and was solubilized individually in 8 M urea and 6 M guanidine hydrochloride and then purified by Ni-NTA affinity chromatography, which was observed as a single band in SDS-PAGE analysis. To correctly refold the obtained immunotoxin, the purified samples were poured into a dialysis bag, and denaturing agents were removed in a multi-step process called stepwise dialysis. The reactivity assessment of the purified and refold immunotoxin was assessed by ELISA technique using A431 cell lysate. Findings: The immunotoxin (17 mg/ml) was expressed using the bacteria cells in the form of inclusion bodies. The refolded humanized immunotoxin had a high reactivity with A431 cells, indicating the suitable folding of the purified immunotoxin. The 50% binding activity rates of humanized immunotoxin obtained from urea and guanidine hydrochloride approaches were 0.8 and 1.7 µg/ml, respectively. Discussion & Conclusion: The results of this study revealed that the urea approach was very effective in solubilizing and proper refolding of immunotoxins that were expressed in bacteria cells as inclusion bodies