ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ ﯾﮑﯽ از ﻣﻮﺗﯿﻒﻫﺎي ﻣﻮﺛﺮ در ﭘﺎﯾﺪاري ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ ATG8B در ﺟﺎﯾﮕﺎه LDS در ﮔﯿﺎه Marchantia polymorpha

Identification of one of the efficient motifs on the stability of ATG8B protein in LDS in Marchantia polymorpha

اتوفاژي يكي از پاسخ‌هاي دفاعي در موجودات مختلف در شرايط تنش و غيرتنش است. در اتوفاژي، تركيبات و اندامك‌هاي آسيب‌ديده درون وزيكول دو غشايي به نام اتوفاگوزوم قرار مي‌گيرند و به سمت واكوئل هدايت مي‌شوند تا توسط آنزيم‌هاي هيدروليتيكي واكوئل تخريب و به مواد اوليه تجزيه شوند. پروتئين ATG8 مشخصه مسير اتوفاژي است كه در شكل‌گيري اتوفاگوزوم و قرارگيري محموله‌هاي هدف براي تخريب شدن درون اتوفاگوزوم نقش دارد. در مسير اتوفاژي انتخابي، حضور پذيرنده محموله براي قرارگيري محموله درون اتوفاگوزوم نقش مهمي ايفا مي‌كند. پذيرنده‌ها داراي موتيف اتصال به ATG8 به نام AIM‌ يا LIR هستند كه مي‌توانند با دمين LDS كه جايگاه اتصال AIM/LIR‌ درATG8 است، ميانكنش دهند. هرگونه تغيير در جايگاه LDS و يا موتيف AIM، سبب برهم خوردن ميانكنش ATG8‌ و پذيرنده مي‌شود. در تحقيق حاضر، گياه Marchantia polymorpha با ATG8B‌ جهش‌يافته در جايگاه LDS از طريق جهش هدفمند در محل، ايجاد شدند تا براي مطالعات آتي براي شناسايي پذيرنده‌هاي احتمالي مورد استفاده قرار گيرند. بدين منظور از طريق بلاست پروتئيني، توالي پروتئين ATG8B در گياه ماركانتيا در پايگاه اطلاعاتي Marchantia.info شناسايي شد. از طريق هم‌رديفي پروتئين‌هاي ATG8A از گياه آرابيدوپسيس با ATG8B‌ گياه ماركانتيا، اسيدآمينه­هايي كه در تاخوردگي ATG8 و شكل‌گيري جايگاه LDS‌ نقش دارند، شناسايي شدند. دو آمينواسيد ليزين 51 و آرژنين 70، جداگانه با روش جهش هدفمند در محل با آمينواسيد آلانين جايگزين شدند. سپس پروتئين فلورسنت GFP‌ با كمك فناوري گرين‌گيت به پروتئين جهش‌يافته ATG8B اتصال يافت. به منظور حفظ شرايط يكسان با گياهان حاوي ژن ATG8B‌ وحشي موجود در آزمايشگاه، با طراحي آغازگرهاي سازگار با گيت‌وي، پروتئين‌هاي جهش يافته درون سازه بياني pMpGWB303 وارد و پس از انتقال به اگروباكتري سويه‌ GWB303+pSOUP به گياه انتقال داده شد. بررسي گياهان تراريخته در آزمايشات وسترن بلات نشان داد كه تنها فرم تغيير يافته ليزين به آدنين قابليت بيان شدن و تشكيل پروتئين پايدار را دارد، در حاليكه با تغيير آرژنين به آلانين، پروتئين پايداري خود را از دست داده و قابليت بيان ندارد.

Autophagy is one of the defensive response pathways under stress and non-stress conditions in different organisms. In autophagy, damaged compounds and organelles are sealed into double-membrane vesicles as an autophagosome. Autophagosome has been directed to the vacuole to be degraded by hydrolytic enzymes into initial substances. ATG8 proteins are the hallmark of this pathway. These proteins are involved in autophagosome formation and target cargo location inside the autophagosome. In selective autophagy, cargo receptors play an important role in trapping the cargo inside the autophagosome. There is the ATG8 binding motif called AIM or LIR in Cargo receptors. This motif makes able the cargo receptors interact with LDS, LIR docking site in ATG8. Any modification in the AIM motif or LDS could abolish the interaction between ATG8 and cargo receptors. In this study, ATG8B mutant in LDS has been generated in Marchantia polymorpha for future studies to identify the possible cargo receptors. In this order, the protein sequence of ATG8B has been identified in the marchntia.info database. Aligning ATG8A from Arabidopsis with ATG8B from Marchantia leads to identifying the residues involving in ATG8B folding and LDS formation. Two residues, Lysin 51 and Arginine 70, have been replaced with Alanine residue by site-directed mutagenesis. The GreenGate has been used for fusing the GFP to ATG8B mutant fragments. To consider the same condition with wild-type ATG8B lines presented in the lab, by using the Gateway adapted primers, ATG8B-LDS mutant has been cloned in the expression vector, pMpGWB303. After transforming to Agrobacterium GWB303+pSOUP strain, it has been transformed to the plants. Analyzing the transformed plants in western blot experiments has shown that the only form of modification that can express and fold as a stable protein is Lysine to Alanine modification, however, in the proteins with the mutation of Arginine to Alanine, protein is not stable, and it cannot be expressed.