سكانس كامل سويه IR Clone12 مشتق شده از سويه لاسوتا ويروس نيوكاسل مؤسسه رازي به روش كلونينگ

Determination of the complete nucleotide sequence of Clone IR 12 strain derived from the LaSota strain of Newcastle Virus of Razi Institute

در چند سال اخير بيماري نيوكاسل در صنعت طيور خسارات گسترده‌اي از جهت تلفات و افت توليد در مزارع پرورش مرغ گوشتي، تخمگذار و مادر گوشتي در كشور ايجاد نموده است. استفاده گسترده از واكسن‌هاي زنده و غيرفعّال نيوكاسل سطح ايمني را تا حد زيادي افزايش مي‌دهد، امّا هنوز بيماري نيوكاسل مسئله مهمي در كشورهاي در حال توسعه نظير ايران مي‌باشد. تحقيق حاضر با هدف تعيين توالي كامل ويروس نيوكاسل سويه Clone12 IR مشتق شده از سويه لاسوتا انجام گرفت. ابتدا ويروس به تخم‌مرغ جنين‌دار SPF 10 روزه تزريق شد.پس از 72 ساعت مايع آلانتوئيك جمع‌آوري شد. مايع آلانتوئيك با كمك سانتريفوژ دور بالاو گراديانت ساكارز به صورت مناسب تخليص شد. RNA ويروسي با كيت تجاري مناسب استخراج شد. با استفاده از يك جفت پرايمر اختصاصي (GSP) دو قطعه cDNA ساخته شد. بدون درنظرگرفتن جايگاه ژني هفت جفت پرايمر طراحي و ژنوم ويروس با روش PCR آمپلي‌فاي شد. هر محصول PCR طولي برابر با (kb 5/2-2) را شامل مي‌شد. محصول PCR از روي ژل آگارز يك درصدالكتروفورز استخراج و بر روي پلاسميد pJET1.2 به نسبت سه به يك ligate شد، در ادامه به باكتري TOP10 ترانسفورم شد. پس از تكثير پلاسميد استخراج گرديد. براي اطمينان از كلونينگ موفق آنزيم برش Bgl II استفاده شد. پلاسميدها براي تعيين توالي به روش سنگر به شركت تجاري معتبر ارسال شد. در نهايت با استفاده از نرم‌افزار مگا5، تمام 15186 نوكلئوتيد تعيين توالي گرديد. و در Gene Bank با كد MH247189 به ثبت رسيده و قابل دسترسي مي باشد. ORF شروع و پايان هر ژن مشخص شد.

Newcastle disease (ND) is an important viral disease of poultry causing severe economic losses and drop in egg production in broiler and layers flocks. Despite vaccination with both live attenuated and inactivated NDV strains to immunize birds, ND is still a serious problem in poultry industry especially in developing countries like Iran. plaque purified NDV strain clone IR12 produced by Razi Institute was propagated in 10-day-old SPF emberyonated chicken eggs, then allantoic fluid was harvested. The virus was purified using sucrose-gradient. RNA was extracted and cDNA spanning the whole genome was synthesized using two GSP primers. PCR was run using 7 sets of primers covering the whole cDNA.The PCR products were all gel extracted and ligated to pJET1.2 vector by 3-1 ratios. Successful cloning of each insert was confirmed using restriction enzyme BglII that digests areas flanking the insert in pJET. After confirmation, the inserts were sequenced using Sanger sequencing with pJEt specific primers as well as primers designed to bind to middle regions of each fragment. Sequence of the whole 15186 bp genome was determined by assembling sequences using MEGA 5software. Location of each start (S) and ending (E) gene signals as well as all ORF start and termination codons were determined.