شناسايي ژن مربوط به آنزيم P450 مسئول توليد آلكالوئيد كيلانتيفولين درگياه Chelidonium majus L. با استفاده از مخمّر مهندسي ژنتيك شده Pichia pastoris

Characterization of P450 enzyme gene responsible for Cheilanthifoline alkaloid in greater celandine (Chelidonium majus L.) by transgenic yeast Pichia pastoris

گياهان منشأ اصلي توليد متابوليت‌هاي ثانويه با ارزش دارويي بالا مي‌باشند. مهمترين عضو اين تركيب‌هاي با ارزش، آلكالوئيدها با مصارف مختلف دارويي هستند. با توجه به توليد محدود برخي از اين مواد در گياهان، به‌عنوان روش جايگزين، با شناسايي و انتقال ژن‌هاي مسئول سنتز آنزيم‌هاي سازنده آلكالوئيدها از گياهان به ميكروارگانيسم‌ها مي‌توان به‌صورت تجاري اين گونه از مواد دارويي را به‌صورت طبيعي توليد كرد. در اين راه، شناسايي ژن‌هاي مسئول آنزيم‌هاي سنتزكننده قدم نخست چنين اقدامي است. در بين آنزيم‌هاي سنتزكننده تركيب‌هاي آلكالوئيدي، آنزيم‌هاي سيتوكروم P450 نقش مهمي دارند. با توجه به وابستگي اين آنزيم‌ها به وجود شبكه اندوپلاسمي و خصوصيات گليكوپروتئيني اين آنزيم‌ها، نمي‌توان آنها را در سيستم‌هاي باكتريايي استاندارد بيان كرد. بنابراين مي‌توان از ميزبان‌هاي يوكاريوتي مانند مخمّر يا سلول حشرات براي بيان آنها استفاده كرد. در اين تحقيق، با استفاده از توالي آمينو اسيدي شناخته شده كيلانتيفولين سنتاز گياه شقايق كاليفرنيايي و مقايسه فيلوژني اين توالي با توالي‌هاي آمينو اسيدي هومولوگ گياه ماميران بدست‌آمده از پايگاه داده بيوانفورماتيك، به‌صورت نظري شش آنزيم سيتوكروم P450 با درصد هومولوژي بالا مسئول سنتز آنزيم كيلانتيفولين سنتاز در گياه ماميران (Chelidonium majaus L.) شناسايي شد. براي اثبات عملي كارآيي اين آنزيم‌ها، ژن‌هاي آنها در وكتور pPIC3.5 كلون شده و بعد با انتقال اين وكتورهاي نوتركيب به سلول مخمّر Pichia pastoris و در اختيار قرار دادن آلكالوئيد اسكولرئين، توليد آلكالوئيد كيلانتيفولين توسط ميكروب‌هاي انتقال ژن داده شده توسط دستگاه LC-MS بررسي گرديد. نتايج نشان داد كه از بين ژن‌هاي كلون و معرفي شده آن آنزيم‌ها به ميزبان مخمّر، تنها آنزيم Contig8931 فعاليت كيلانتيفولين سنتازي دارد.

Plants are the main sources of secondary metabolites with high medical value. The most important member of these valuable compounds are alkaloids with the different drug purposes. Concerning the limited production of some of these metabolites in the plants, these medicinal compounds can be produced naturally and commercially with the identification and transfer of alkaloids-producing enzymes corresponding plant genes to the microorganisms as an alternative method. In this way, the characterization of the corresponding genes is the first step. Among the different enzymes involved in the alkaloid biosynthesis, the cytochrome P450 enzymes play an important role. Due to the endoplasmic reticulum (ER) localization of these enzymes and their glycoprotein characters, they cannot be expressed functionally in the standard bacterial systems. Consequently, the heterologous expression aimed to verify the enzymatic activity can favorably be performed using the eukaryotic systems, like yeast or insect cells. Herein, in this study, with employing a phylogenic comparison of cheilanthifoline synthase sequence of Eschscholzia californica Cham. and comparing the sequence with the homolog amino acid sequences of Chelidonium majus L. achieved from bioinformatics databases, six cytochrome P450 enzymes responsible for cheilanthifoline synthase in Ch. majus were identified. To prove the efficacy of these enzymes practically, their genes were cloned into the pPIC3.5 vector. Then, these recombinant vectors were transferred to the yeast cell (Pichia pastoris) and the scoulerine alkaloid was given to its media. Finally, the cheilanthifoline alkaloid microbial production by P. pastoris containing the recombinant plasmids was evaluated by LC-MS. The results of the present study indicated that among the enzymes genes cloned and introduced to the yeast host, only the Contig8931 enzyme had the cheilanthifoline synthase activity.