جداسازي ژن مونوترپن‌سنتاز (NsTPS2) و بررسي تركيبات ترپنوئيدي در گياه دارويي سياهدانه (Nigella sativa L.)

Isolation of Monoterpene Synthase Gene (NsTPS2) and Evaluation of Terpenoid Compounds in Black Cumin Medicinal Plant (Nigella sativa L.)

سياهدانه (Nigella sativa) گياهي دارويي از خانواده Ranunculacea است كه به‌دليل خواص دارويي آن مورد توجه بسياري قرار گرفته است. اهميت پزشكي سياهدانه عمدتاً به مونوترپن‌هاي اكسيژن‌دار آن نسبت داده مي‌شود كه از طريق مسير متيل‌اريتريتول‌فسفات در پلاستيدها بيوسنتز مي‌شوند. در اين تحقيق تركيبات اسانس برگ، گل و مراحل نموي بذر، شامل بذرهاي نيمه‌سياه، سياه‌نرم و سياه‌سخت در گياه سياهدانه مورد تجزيه و تحليل قرار گرفت. درحالي‌كه هيچ تركيب ترپني در گل‌ها و برگ‌ها مشاهده نشد، مشخص شد كه دانه‌ها محل اصلي بيوسنتز و تجمع ترپن‌ها هستند و مقدار تركيبات ترپني طي بلوغ بذر تغيير مي‌كند. مونوترپن‌ها (بيشتر از 99 درصد) و سزكويي‌ترپن‌ها (كم‌تر از 1 درصد) اسانس را تشكيل دادند. به‌منظور بهبود درك ما از متابوليسم مونوترپن‌ها، توالي جزئي يك مونوترپن‌سنتاز فرضي (NsTPS2) با استفاده از روش RACE-PCR از گياه سياهدانه جدا شد. اين مونوترپن‌‌سنتاز از داده‌هاي حاصل از توالي‌يابي RNA از بذرهاي سياه‌نرم سياهدانه شناسايي شد. به‌جز وجود موتيف بسيار حفاظت‌شده DDXXD در NsTPS2 كه براي تأييد شناسايي مونوترپن‌ها ضروري است، نواحي حفاظت‌شده ديگري از ساير مونوترپن‌سنتازهاي شناسايي شده از ساير گونه‌هاي گياهي مشاهده نشد. نتايج حاصل از درخت فيلوژني نشان داد كه NsTPS2 بيشترين شباهت را با يك ترپن‌سنتاز (72.89 درصد) از گياه تاج‌الملوك (Aconitum carmichaelii) دارد و در يك گروه قرار گرفتند. سياهدانه و تاج‌الملوك هر دو به خانواده‌ي آلاله تعلق دارند و اين نشان مي‌دهد كه مي‌توان از اطلاعات ژنتيكي گياهان هم‌خانواده سياهدانه براي جداسازي مونوترپن‌سنتازهاي مختلف استفاده كرد. اطلاعات حاصل از اين تحقيق مي‌تواند در راستاي اهداف دست‌ورزي ژنتيكي و مهندسي متابوليك در سياهدانه بسيار مفيد باشد.

Black cumin (Nigella sativa) is a medicinal plant of the Ranunculacea family which raised attention due to its pharmaceutical properties. Medical significance of N. sativa mainly attributed to its oxygenated monoterpenes which are biosynthesized via the methyl erythritol phosphate (MEP) pathway located in plastids. In this study, the essential oil components of leaves, flowers, and developmental stages of seed including half black seeds, soft black seeds, and hard black seeds were analyzed in N. sativa. Whereas no terpene was detected in flowers and leaves, seeds were found to be the major site of biosynthesis and accumulation of terpenes, and the amount of terpene compounds changed during seed maturation. The essential oil consists of monoterpenes (more than 99%) and sesquiterpenes (less than 1%). In order to improve our understanding of monoterpene metabolism, the partial sequence of a hypothetical monoterpene synthase (NsTPS2) was isolated from N. sativa plant using RACE-PCR technique. This monoterpene synthase was identified from RNA sequencing data from soft black seeds. Except of the highly conserved DDXXD motif in NsTPS2 which is necessary to validate monoterpene synthases, no other conserved regions of other identified monoterpene synthases were observed. Dendrogram analysis revealed that NsTPS2 had the highest homology with a terpene synthase (72.89%) from Aconitum carmichaelii and these two sequences were grouped in the same group. Nigella sativa and Aconitum carmichaelii both belong to the Ranunculacea family. This indicates that the genetic information of plants of the Ranunculacea family can be used to isolate different monoterpene synthase. The results of this research can be useful in genetic manipulation and metabolic engineering of Nigella sativa.