بيان نوتركيب بخش C-ترمينال پروتئين Rif1 و محلول سازي آن با ساركوزيل

The expression of Recombinant C-terminal domain of Rif1 Protein and its Solubilization with Sarcosyl

ژنوم يوكاريوتي حاوي چندين محل شروع همانندسازي مي¬باشد. بررسي¬ها نشان مي¬دهد كه روند و ترتيب فعال شدن اين منشأها با نظم خاصي صورت مي¬گيرد كه اين فرآيند منظم را اصطلاحاَ زمانبندي همانندسازي (Replication timing) مي-گويند. مطالعات اخير نشان مي¬دهد كه فاكتورهاي زيادي در تنظيم زمانبندي فرآيند همانندسازي نقش دارند. يكي از مهمترين اين فاكتورها پروتئين متصل¬شونده به Rap1 (Rif1)، مي¬باشد كه نقش اساسي را در تنظيم برنامه زمانبندي همانندسازي در مخمر و يوكاريوت هاي پيشرفته¬تر ايفا ميكند. قسمت عمده ساختار اين پروتئين به صورت نامنظم بوده و اين ويژگي¬ها مانع از بيان Rif1 به صورت پايدار شده و مطالعه بر روي آن را دشوار مي كند. هدف از مطالعه كنوني بيان نوتركيب دمين C-ترمينال پروتئين Rif1 موشي (muRif1-CTD) به صورت محلول مي¬باشد. بدين منظور ژن muRif1-CTD از سازه يوكاريوتي حاوي ژن كامل Rif1 به كمك PCR استخراج و در وكتور بياني pPAL7 كه حاوي برچسب Profinity eXact بود، قرار گرفت. محلول¬سازي پروتئين با استفاده از دترجنت¬هاي مختلف و در مرحله بعد حذف دترجنت با استفاده از دياليز صورت پذيرفت. به منظور اطمينان از اينكه پروتئين محلول شده داراي فعاليت است آناليز برهمكنش پروتئين Rif1 با ساختار G4 (كه قبلا در رابطه با اتصال به Rif1 معرفي شده بود) با روش ژل شيفت مورد بررسي قرار گرفت. نتايج اين بررسي نشان داد كه استفاده از دترجنت مي¬تواند براي محلول سازي پروتئين Rif1 بدون اثرگذاري بر مراحل خالص¬سازي آن مورد استفاده قرار گيرد. ليكن در مورد اين پروتئين در صورت فقدان كامل دترجنت، اين پروتئين به صورت محلول نخواهد بود.

The eukaryotic genome contains several replication Origins. Studies showed that the phenomenon and order of the origin activation is in a particular discipline, called the “Replication Timing". Recent studies show that many factors are involved in regulating the timing of the replication process. One of the most important factors amongst them is the Rap1 interacting Factor 1 (Rif1) protein, which plays a key role in regulating the replication schedule in yeast and more advanced eukaryotes. Structure of this protein is mostly irregular and these properties prevent Rif1 from being expressed in a stable manner and makes it difficult to study. The aim of the present study was to investigate the expression of recombinant C-terminal domain of mouse-Rif1(muRif1-CTD) protein in solution. For this purpose, the muRif1-CTD gene was extracted from eukaryotic constructs containing the complete Rif1 gene by PCR and was inserted into the pPAL7 expression vector comprising the Profinity eXact tag. Protein solubilization was carried out using different detergents and then detergent removal was performed by dialysis. In order to ensure that the soluble protein is active, the interaction analysis of the Rif1 protein with the G4 structures (previously reported to bind Rif1) was investigated using the gel shift assay. The results of this study showed the use of detergent for Rif1 solubilization without affecting its purification steps. But in the case of this protein, if the detergent is removed completely, it will not remain soluble.