كلونينگ، بيان و تخليص دومين BRICHOS حاصل از Bri2 و خاصيت ضد تجمعي آن

Cloning, expression and purification of the BRICHOS domain from Bri2 and its anti-amyloidogenic effects

رسوب پروتئين ها در اثر فرآيند تجمعدر درون يا بيرون سلول ها باعث ايجاد بسياري از بيماري هايعصبي نظير آلزايمر، تشنج هانتينگتون يا پاركينسون ميشود. بيماري پاركينسون پس از آلزايمر دومين بيماري شايععصبي است كه طي آن در اثر تجمع اجسام لوي و تخريب نورون هاي دوپامين اختلالات حركتي در بيماران به وجود مي آيد. پروتئين آلفا سينوكلئين حاوي 140 اسيد آمينه، اصلي ترين پروتئين شناخته شده در تجمعات اجسام لوي است. طي فرآيند تجمع، مونومرهاي پروتئيني آلفا سينوكلئينبصورت اليگومر به هم متصل شده و در نهايت بصورت رشته هاي آميلوئيدي در مي آيند. تاكنون دارويي براي توقف يا به تاخير انداختن پيشرفت پاركينسون وجود نداشته اما مطالعات بر مكانيسم مولكولي تشكيل آميلوئيدها و شناسايي مهار كننده هاي آن در حال افزايش است. بدين منظور در اين تحقيق تاثير دمين BRICHOSحاصل از BRI2 كه مي تواند وظايف مختلفي از جمله خاصيت ضد تجمعي داشته باشد بر فرايند تجمع آلفا سينوكلئينبه عنوان پروتئين مدل بررسي گرديد. ژن مورد نظر ابتدا بهينه و سنتز گرديد و سپس توسط PCRتكثير گرديد. محصول توسط آنزيم هاي Xho I و Nde1هضم آنزيمي شده و وارد وكتور بيانيpET28a گرديد كه به باكتري E.Coliترانسفورم شد. در آخر پپتيد مورد نظر با كروماتوگرافي نيكل سفارز تخليص شد. ژن آلفا سينوكلئين نيزبه صورت مجزا بيان و تخليص گرديد. اثر ضد تجمعي دمينBRICHOSبر فيبريلاسيون آلفا سينوكلئين با استفاده از روش فلورسانس تيوفلاوين Tو تكنيك TEMبررسي شد.

Protein deposition due to the process of accumulation inside or outside cells causes many neurological diseases such as Alzheimer's, Huntington's or Parkinson's seizures. Parkinson's disease is the second most common neurological disease after Alzheimer's, in which patients develop disorders due to the accumulation of leprosy and the destruction of dopamine neurons. Alpha-synuclein protein contains 140 amino acids, the main protein known in lewy body accumulations. During the aggregation process, alphasynuclein protein monomers bind together as oligomers and eventually become amyloid filaments. So far, there is no drug to stop or delay the progression of Parkinson's, but studies on the molecular mechanism of amyloid formation and the identification of inhibitors are increasing. For this purpose, in this study, the effect of BRICHOS domain resulting from BRI2, which can have various functions, including antimicrobial properties, on the process of alpha-synuclein accumulation as a model protein was investigated. The gene was first optimized and synthesized and then multiplied by PCR. The product was digested by enzymes Xho I and Nde1 and cloned into the expression vector pET28 a, which was then transformed into E. coli bacteria. Finally, the peptide was purified by nickel chromatography. The alpha-synuclein gene was also expressed separately and purified. The anti-cumulative effect of BRICHOS domain on alphasynuclein fibrillation was investigated using Thioflavin T fluorescence method and TEM technique.