جداسازي و كلونينگ ژن پروتئين سطحي (psp) استرپتوكوك پنومونيه در باكتري اشريشياكلي DH5 آلفا جهت دستيابي به واكسن

زمينه و هدف: استرپتوكوك پنومونيه يا پنوموكوك، ديپلوكوك گرم مثبت به قطر ۵/۰ تا ۲/۱ ميكرومتر، آلفا هموليتيك و تحمل‌كننده اكسيژن از جنس استرپتوكوكوس و عامل بيماريهايي چون مننژيت و ذات الريه مي‌باشد.باكتري حامل ژن پروتئين سطحي Pneumococcal A (PspC)از S بوده و هدفي اميدواركننده براي فرمولاسيون هاي واكسن جديد است. به همين جهت هدف از انجام اين تحقيق جداسازي و كلونينگ ژن پروتئين سطحي (psp) استرپتوكوك پنومونيه در باكتري اشرشياكلي DH5 آلفا به منظور تهيه واكسن براي كودكان مي‌باشد. مواد و روش‌ها: نمونه‌ها از تعداد 100 كودك سالم، در مهـد كودك هـاي شـهر اراك به طور تصادفي از نازوفارنژيال كودكان سالم زيـر 6 سـال بود كه در مجموع 12 ايزوله پنوموكوك جداسـازي شد. به منظور جداسازي و شناسايي اوليه استرپتوكوك پنومونيه از محيط كشت و آزمون هاي بيوشيميايي استفاده شد و استخراج DNA صورت گرفت. از طريق آزمون PCR سويه هاي واجد ژن pspC شناسايي شد. ژن pspC سويه هاي مثبت از طريق وكتور به باكتري ميزبان اشرشياكلي الحاق و از طريق تكنيك TA كلونينگ كلون شدند و در پايان از طريق تكنيك Real time PCR ميزان بيان ژن‌ها در اشرشيا كلي DH5 آلفا سنجيده و براي رسم درخت فيلوژني از نرم‌افزار clustalX و Mega5 استفاده شد. يافته ها: از غربالگري نمونه هاي باليني ارسالي به آزمايشگاه كه براساس خصوصيات مورفولوژيك، ميكروسكوپي و تست هاي بيوشيميايي تعيين هويت شدند در مجموع 12 ايزوله پنوموكوك جداسازي شد. و از اين تعداد 1 ايزوله داراي ژن pspC بود. پس از كلونينگ، ژن هاي pspC، سويه هاي كلون شده كلني سلكشن (آبي/سفيد) جداسازي شدند. به منظور تاييد نتايج كلونينگ DNA , از كلني هاي مشكوك استخراج و توسط آزمون Real time PCR گرديد. در نهايت تصاوير سكانسينگ‌، m13 و منحني تكثير، بيان ژن در باكتري اشريشياكلي DH5 alpha; را تاييد كرد. نتيجه گيري: در اين مطالعه با ارزيابي ژنومي پنوموكوك جدا شده از كودكان زير 6 سال‌، ژن pspC با پتانسيل ايمن سازي و به منظور ساخت واكسن از اين باكتري استخراج گرديد و كلونينگ با موفقيت صورت گرفت. در نهايت با بررسي درخت فيلوژني رسم شده در اين مطالعه ميزان تشابه و خويشاوندي گونه استرپتوكوك پنومونيه با ساير گونه‌ها نشان داده شد.