ايجاد سازواره ژني براي حذف ژن sipA از باكتري سالمونلا تيفي موريوم: مطالعه آزمايشگاهي

GENERATION OF A GENE CONSTRUCT TO SIPA GENE DELETION OF SALMONELLA TYPHIMURIUM

پيش‌زمينه و هدف: باكتري سالمونلا تيفي موريوم يك باسيل گرم منفي، بدون اسپور، فاقد كپسول، متحرك و داراي فلاژل‌‌ها يكي از شايع‌ترين پري‌تريش است. سالمونلا عامل مسموميت‌‌‌هاي غذايي مي‌باشد. توانايي وارد شدن و زنده ماندن در سلول‌هاي ميزبان شرط لازم براي بيماري‌زايي گونه‌هاي سالمونلا است. پروتئين تهاجمي سالمونلا يك فاكتور بيماري‌زايي مهم است كه توسط باكتري به سلول‌هاي ميزبان منتقل مي‌شود. اين مطالعه با هدف ساخت سازواره‌ي ژني براي حذف ژن SipA از باكتري سالمونلا تيفي موريوم و كلون ‌سازي آن در باكتري اشريشيا كلي انجام گرفت. مواد و روش‌ كار: اين مطالعه آزمايشگاهي از مهر 1396 تا خرداد 1397 در مركز تحقيقات بيوتكنولوژي دانشگاه آزاد اسلامي واحد شهركرد انجام گرفت. در اين تحقيق توالي 5' و 3' ژن SipA به كمك پرايمرهاي اختصاصي آن‌ها و روش PCR تكثير گرديد. سپس هركدام از اين توالي‌ها به روش T/Acloning در حامل pGEM-Teasy كلون و سپس به باكتري اشريشيا كلي ترانسفورم گرديد. با استفاده از روش PCR قطعات مربوط به هر ناحيه تكثير و تأييد گرديد. تأييد نهايي سازواره‌ي حاصل با استفاده از آنزيم‌هاي XbaI و XhoI انجام گرفت. يافته‌ها: نتايج نشان‌دهنده‌ي كلون‌ سازي موفقيت‌آميز ژن موردنظر در باكتري اشريشيا كلي و ساخت سازواره‌ي ژني به طول 1520 جفت باز بود. همچنين حامل pET32 به طول 5900 جفت باز ازلحاظ ظرفيت پذيرش بهترين نوع حامل در پذيرش توالي سازواره بود. بحث و نتيجه‌گيري: با توجه به نتايج حاصل در اين مطالعه به نظر مي‌رسد كه مي‌توان با قرار دادن يك ژن، ژن آسيب‌زا را حذف و از آن به‌عنوان واكسن تضعيف‌شده عليه سالمونلوزيس مورد استفاده قرار نمود. به‌طوري‌كه مي‌توان با روش الكتروپوريشن اين سازواره را وارد باكتري سالمونلا تيفي موريوم كرد و سپس به‌واسطه تشابه توالي‌ها‌ي فرادست و فرودست ژن sipA و Kan نوتركيبي همولوگ بين اين دو ژن اتفاق مي‌افتد و ژن بيماري‌زا حذف خواهد شد.

Background & Aims: Salmonella Typhimurium is a negative-gram, non-spore, free capsule, moving bacteria with Trish Perry flagella. Salmonella is the most common cause of food poisoning. The ability to enter and survive in host cells is the condition for pathogenic Salmonella species. Proteins of invasive Salmonella are transferred to the host cells by bacteria. This study was performed for generation of a gene construct to SipA gene deletion of Salmonella Typhimurium and its cloning in E.Coli bacteria. Materials & Methods: This laboratory study was conducted in biotechnology research center of Islamic Azad University Shahrekord Branch from September 2017 to May 2018. In this study, 5' and 3' sequence of SipA gene was amplified by the specific primers and PCR method. Then, each of these sequences was cloned by the T/A cloning method in pGEM-Teasy vector and then was transformed into E.Coli bacteria. Using the PCR method, the part related to each region was amplified and confirmed. The final confirmation of the produced construct was performed by the Xbal and Xhol enzymes. Results: The results indicated the successful cloning of the target gene in E.Coli and generation of a gene construct with a length of the 1520 bp. Also, pET32 vector with a length of 5900 bp was the best vector for the admission construct. Conclusion: Based on the results, it seems that by inserting a gene, the damaged gene can be deleted and it can be used in the future research as a gene vaccine against Salmonellosis. Also, the target gene can be deleted with electroporation method and transferred into Salmonella Typhimurium, and due to the similarities between upstream and downstream gene sequences of sipA and Kan genes, homologous recombination between these two genes can occur and pathogenic genes will be removed.