طراحي و ساخت سازه‌هاي بياني نوتركيب به منظور توليد و ترشح پروتئين‌هاي نوتركيب در ريشه‌هاي موئين

هدف: استفاده از سيستم‌هاي بياني گياهي براي توليد پروتئين‌هاي نوتركيب داراي مزايايي از جمله وجود روش‌هاي متفاوت تراريختي و كشت، وقوع تغييرات مناسب پس از ترجمه و عدم خطر آلودگي با عوامل بيماري‌زاي حيواني و ميكروبي مي‌باشد. با اين‌حال ميزان كم توليد محصول در اين سيستم‌هاي بياني، همواره به عنوان چالشي عمده مطرح است. سيستم‌هاي بياني مبتني بر ترشح در كشت ريشه‌هاي موئين، مي‌توانند راه‌كار مناسبي براي توليد پيوسته‌ مواد موثره بدون نياز به تخريب بافت گياهي باشند و به نوبه‌ خود، موجب سهولت فرآيند خالص‌سازي و كاهش قابل توجه هزينه‌هاي مربوط به آن ‌شوند. اين پژوهش با هدف طراحي و ساخت سازه‌هايي با تلفيق همزمان پيشبر اختصاصي ريشه NtREL1 با سه ترادف نشانه پاتاتين، پكتين متيل استراز و كالرتيكولين براي افزايش بيان اختصاصي پروتئين‌هاي نوتركيب در كشت ريشه‌هاي موئين و در ادامه ترشح آنها به درون محيط كشت مايع به انجام رسيد. مواد و روش‌ها: توالي نوكلئوتيدي پيشبر اختصاصي ريشه‌اي NtREL1 و پپتيدهاي نشانه پاتاتين، پكتين متيل استراز و كالرتيكولين از پايگاه داده NCBI دريافت گرديد. توالي اين پيشبر به منظور شناسايي عناصر تنظيمي Cis دخيل در بيان اختصاصي ريشه‌اي توسط نرم افزارهاي PLACE و PLANT CARE مورد بررسي قرار گرفت. مطالعات بيوانفورماتيكي به منظور طراحي سازه‌هاي بياني pBI121 واجد توالي نوكلئوتيدي پيشبر در تركيب با پپتيدهاي نشانه به انجام رسيد و جايگاه‌هاي برشي مناسب در دو سر قطعات مورد نظر طراحي گرديد. پس از دريافت قطعات سنتزي در ناقل pUC57، قطعات با واكنش هضم آنزيمي جداسازي شده و در سازه بياني pBI121 همسانه‌‌سازي شدند. نتايج: بررسي پيشبر NtREL1 نشان داد اين پيشبر، غني از نوكلئوتيدهاي AT است. اين توالي‌ها به دليل سهولت در تبديل از شكل دو رشته‌اي به تك رشته‌اي،  موجب بهبود فرآيند شناسايي توسط سيستم‌هاي رونويسي و  افزايش بيان ژن‌ها مي شوند. صحت همسانه‌سازي پيشبر NtREL1 در تركيب با سه پپتيد نشانه پاتاتين، پكتين متيل استراز و كالرتيكولين در سازه بياني pBI121 با استفاده از واكنش كلوني پي‌سي‌آر، هضم آنزيمي و توالي‌يابي قطعات همسانه‌سازي شده در سازه بياني pBI121 با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي، تائيد شد. نتيجه‌گيري: از آنجايي كه ناقل‌هاي بياني مبتني بر pBI121 نسبت به ساير ناقل‌هاي بياني، كارايي بالايي داشته و به طور گسترده در پروژه‌هاي تراريزش ژنتيكي و بيان پروتئين‌هاي نوتركيب در گياهان مورد استفاده قرار مي‌گيرند، ناقل‌هاي نوتركيب ساخته شده در اين پژوهش مي‌توانند به نحوي موثر براي توليد و ترشح پروتئين‌هاي نوتركيب در سيستم‌هاي بياني، مانند كشت ريشه‌هاي موئين مورد استفاده قرار گيرند.