اتصال توالي‌هاي ژني كدكننده‌ي نواحي اپي‌توپي پروتئين‌هاي غيرساختاري ويروس تب برفكي به روش OE-PCR يك مرحله‌اي

هدف: تب برفكي يك بيماري بسيار ويرانگر در حيوانات زوج‌سم مي‌باشد كه خسارات اقتصادي گسترده‌اي در صنعت دامپروري ايجاد مي‌كند. اخيراً روش‌هاي تشخيصي اين بيماري براي رديابي آنتي‌بادي‌هاي عليه پروتئين‌هاي غيرساختاري ويروس تب برفكي بسيار توسعه‌يافته‌اند. پروتئين‌هاي غيرساختاري 3ABC و 3D كه ارائه‌دهنده‌ي اپي‌توپ‌هاي خطي سلول‌هاي B هستند، تشخيص مؤثر دام‌هاي آلوده به ويروس را امكان‌پذير مي‌كنند. در اين تحقيق، اپي‌توپ‌هاي خطي ايمني‌زاي غالب از پروتئين‌هاي 3ABD براي طراحي ساخت توالي ژني جديد و اتصال قطعات 3AB و 3D در نظر گرفته شد.  مواد و روش‌ها: از تكنيك گسترش نواحي همپوشان به كمك واكنش زنجيره‌اي پليمراز (OEPCR) براي سنتز توالي 3ABD آنتي‌ژني استفاده شد. RNA ويروسي از سلول‌هاي BHK آلوده به ويروس جداسازي و رونويسي معكوس شد. براي حذف توالي مياني 654 نوكلئوتيدي ژن3C ، يك جفت آغازگر داخلي با 29 نوكلئوتيد همپوشان و يك جفت آغازگر خارجي طراحي شدند. قطعات 3AB و 3D هركدام در واكنش‌هاي جداگانه‌ي PCR تكثير شدند و پس از الكتروفورز از ژل تخليص شدند. اين قطعات به عنوان الگو در OEPCR براي سنتز توالي 3ABD به كمك آغازگرهاي خارجي و آنزيم Pfu‌‌پليمراز در يك واكنش يك مرحله‌اي مورداستفاده قرار گرفتند. نتايج: نتايج اين مطالعه نشان داد كه هركدام از قطعات 3AB  (418 جفت باز) و 3D  (557 جفت باز) با توالي‌هاي همپوشان به‌ترتيب در انتهاي ’3 و ’5 تكثير شدند. OEPCR منجر به تكثير چندين قطعه شد و قطعه‌ي 3ABD با طول موردنظر (946 جفت باز) پس از توالي‌يابي تاييد شد. تنها با در نظر گرفتن 29 جفت باز همولوژي در طراحي آغازگرهاي همپوشان و يك آنزيم پليمراز با دقت بالا، دو ناحيه‌ي اپي‌توپي از پروتئين‌هاي غيرساختاري ويروس تب برفكي (3’3AB و 5’3D) به هم متصل شدند. نتيجه‌گيري: توالي ژني ساخته شده به روش OEPCR يك مرحله‌اي، علاوه براين كه نواحي آنتي‌ژني پروتئين‌هاي غيرساختاري 3ABD ويروس تب برفكي را دارا مي‌باشد، مشكلات مربوط به هزينه‌ي بالاي سنتز پپتيد را ندارد و مي‌تواند گزينه‌ي مناسبي براي توليد پروتئين نوتركيب و بررسي امكان استفاده در تشخيص بيماري تب برفكي به روش الايزا باشد.