مقايسه بيان ژن CYP51A ايزوله هاي آسپرژيلوس فوميگاتوس در مقابل فلوكونازول و نانو فلوكونازول

Comparison of CYP51A gene expression of Aspergillus fumigatus isolates against fluconazole and nano-fluconazole

آسپرژيلوزيس عفونت قارچي فرصت طلب در انسان و حيوان مي ­باشد. بيماري در طيور عمدتاً تنفسي است ولي ساير تظاهرات بيماري نيز اتفاق مي­افتد. محققين يكي از علل افزايش مقاومت دارويي در گونه­ هاي آسپرژيلوس را، افزايش بيان ژن CYP51A مي ­دانند. هدف از اين مطالعه مقايسه بيان ژن CYP51A ايزوله­هاي آسپرژيلوس فوميگاتوس جدا شده از طيور در مقابل فلوكونازول و نانو­فلوكونازول بود. نانوذرات ليپوزومي فلوكونازول به روش هيدراسيون لايه نازك تهيه شد. مقدار 12/5 ميلي­ گرم از پودر فلوكونازول را در 1 ميلي‌ليتر آب مقطر استريل و سپس در 6 ميلي‌ليتر حلال آلي كلروفرم-متانول حل كرديم و لسيتين و كلسترول به آن اضافه نموديم. اندازه نانوذرات ليپوزومي فلوكونازول 1/12±9/88 نانومتر و بار سطحي اين نانوذرات 1/88±20/12- ميلي­ولت بدست آمد. همچنين به منظور بررسي ساختار نانو­ذرات‌ از ميكروسكوپ الكتروني روبشي استفاده كرديم. 30 نمونه آسپرژيلوس­ فوميگاتوس از ندول­هاي ريه طيور جمع ­آوري گرديد. تست حساسيت دارويي به روش استاندارد Broth microdilution طبق NCCLS-M38A2 جهت بررسي MIC فلوكونازول و نانوفلوكونازول در مقابل ايزوله ­ها انجام شد. تعداد دو عدد از ايزوله ­هاي نشان­دهنده مقاومت بالا به داروي فلوكونازول را انتخاب و براي بررسي بيان ژن CYP51A به روش Real-time PCR استفاده كرديم. نتايج نشان داد، نانوفلوكونازول داراي مقادير MIC پايين­ تري نسبت به فلوكونازول بود و در غلظت­هاي پايين­تري باعث مهار رشد ايزوله­ هاي آسپرژيلوس فوميگاتوس گرديد. بيان ژن CYP51A در ايزوله ­هاي تحت تيمار با فلوكونازول و نانوفلوكونازول نسبت به حالت بدون تيمار افزايش پيدا كرد و همچنين يك روند كاهشي در بيان ژن CYP51A در مواجهه با نانودارو در مقايسه با داروي نرمال مشاهده شد.

Aspergillosis is an opportunistic fungal infection in animals. The disease is mainly respiratory, but other disease manifestations also occur in poultry. Researchers have shown that, one of the reasons for the increase in drug resistance in Aspergillus species is the overexpression of the CYP51A gene. This study compared CYP51A gene expression of Aspergillus fumigatus isolated from poultry against fluconazole and nano-fluconazole. Fluconazole liposomal-nanoparticles were prepared by the thin layer hydration method. We dissolved 5.12 mg of fluconazole powder in 1 ml of sterile distilled water and 6 ml of chloroform-methanol organic solvent. We added 51 mg of lecithin and 5 mg of cholesterol to it. The size of nanoparticles was 88.9±12.1 nm and the surface charge of these nanoparticles was -20.12±1.88 mv. We also used a Scanning-Electron Microscope to study the structure of nanoparticles. Thirty samples of A. fumigatus were collected from poultry lung nodules. Minimum inhibitory concentration (MIC) was performed by standard Broth Microdilution method according to NCCLS-M38A2 to evaluate the MIC of fluconazole and nano-fluconazole against isolates. We selected two high-resistance isolates to fluconazole and used them to determine the CYP51A gene expression level by real-time PCR. The results showed that nano-fluconazole had a lower MIC than fluconazole and in lower concentrations of the drug inhibited the growth of Aspergillus fumigatus isolates. CYP51A gene expression was increased in fluconazole and nano-fluconazole-treated isolates compared to the untreated state. Conversely, a decrease in CYP51A gene expression was observed in the exposure to nano-drug compared with the normal drug.