شناسايي باكتريهاي همزيست غالب دستگاه گوارش بيد غلات (Sitotroga cerealella)

Identification of Sitotorga cerealella digestive system predominant symbiotic bacteria

در اين پژوهش، باكتري هاي هم زيست دستگاه گوارش بيد غلات شناسايي شد.براي پرورش بيد غلات از جو با درصد پروتئين بالا استفاده شد ظرف حاوي جو بعد از آلوده سازي در اطاقك رشد در شرايط دمايي 24 درجه سلسيوس ورطوبت نسبي 65 درصـد نگهـداري شـدند. جهت جدا نمودن باكتري دستگاه گوارش بيد غلات از بين جمعيت پرورش داده شده 10 لارو سالم انتخاب شد. دستگاه گوارش لاروها پس از ضد عفوني در اتانول 70 درصد، هيپوكلريت سديم 5درصد و آب مقطر خارج شد سپس جهت همگن نمودن دستگاه گوارش از يك ميلي‌ليتر بافر فسفات 0.1مولار با ph=7 استفاده شد.محتويات همگن‌ شده در محيط كشت نوترينت آگار كشت داده شدبراي انجام واكنش هاي زنجيره‌اي پليمراز از5 ميكرو ليتر Master Mix ، 2 ميكروليتر DNA استخراج شده ، 1.5 ميكروليتر پرايمر RP2 و 1.5 ميكرو ليتر پرايمر FD1 و 15 ميكروليتر Distilled Water كه حجم كلي اين مواد بايد به 25 ميكرو ليتر برسد. فرآيند PCR با استفاده از پرايمر‌هاي عمومي FD1 و RP2 و توالي ژن 16srRNA در دستگاه ترموسايكلرانجام شد. توالي يابي با همكاري شركت Bioneer انجام شد.ويژگيهاي فنوتيپي باكتري هاي جدا شده با روش هاي استاندارد باكتري‌شناسي مشخص شد. بعد از بررسي تمام كلوني هاي تهيه شده و مقايسه نتايج بدست آمده بيشترين فراواني از نظر تعداد كلني مختص به باكتري mundtii Enterococcus بود و باكتري Enterobacter hormaechei از فراواني كمتري در دستگاه گوارش بيد برخوردار بود. همچنين با توجه به الكتروفورز انجام شده بالاترين باندهاي مشاهده شده مربوط به باكتري hormaechei Enterobacter و كوتاه ترين باند متعلق به mundtii Enterococcus مي باشد.

Sitotorga cerealella is one of the important storage pests .The damage of this pest is very important both in terms of quality and quantity .In this study,symbiotic bacteria of Sitotorga cerealella were identified.Modified barley of Abidar cultivar with high protein content was used to grow grain moth. Containers containing barley were stored in a growth chamber at a temperature of 24 ° C and a relative humidity of 65% after contamination. To separate the bacteria of Sitotorga cerealella gastrointestinal tract,10 healthy larvae were selected from the reared population. After disinfection, the larvae gastrointestinal tract was removed with ethanol 70%, sodium hypochlorite and distilled water5%. Then, one milliliter of 0.1 M phosphate buffer with pH 7 was used to homogenize the gastrointestinal tract. The homogeneous and diluted contents were cultured in nutrient agar medium .To perform polymerase chain reactions from 5 μl of Master Mix ,2 μl of extracted DNA, 1.5 μl of RP2 primer and 1.5 μl of FD1 primer and 15 μl Distilled Water that the total volume of these materials should reach 25 microliters. The PCR process was performed using general primers FD1 and RP2 and 16srRNA gene sequence in a thermocycle.The PCR product sequencing was performed in collaboration with South Korea&s Bioneer and the results were reviewed at the NCBI site. The phenotypic characteristics of the isolated bacteria were determined by standard bacteriological methods. After reviewing all the prepared colonies and comparing the obtained results, the highest frequency in terms of number of colonies was specific to Enterococcus mundtii and Enterobacter hormaechei was less abundant in the gastrointestinal tract of Sitotorga cerealella. Also, according to electrophoresis, the highest bands observed belong to Enterobacter hormaechei and the shortest band belongs to Enterococcus mundtii.