بهينه‌سازي بيان، تخليص و ارزيابي طيف ‌سنجي فلوئورسانس آنزيم كراتيناز در حضور نانوذرات طلا

اهداف: امروزه استفاده از روش‌هاي بر پايه واكنش‌هاي آنزيمي با هدف پايش سلامت افراد به خصوص در حوزه نيروهاي نظامي و انتظامي رواج گسترده‌اي يافته است. يكي از روش‌هاي آنزيماتيك، استفاده از آنزيم كراتيناز براي سنجش كراتين و كراتينين در مايعات جهت بررسي سلامت كليه‌ها، عضلات و غده تيروئيد است. هدف اين تحقيق بهينه‌سازي بيان آنزيم كراتيناز و بررسي اثر نانوذرات طلا بر پايداري آنزيم كراتيناز بود. مواد و روش‌ها: اين پژوهش در بهار و تابستان سال 1400 در مؤسسه الكتروشيمي واقع در دانشگاه تهران انجام شد. در اين مطالعه ابتدا باكتري E.Coli BL21 حاوي وكتور تكثيري pET28a در محيط TB كشت شد، سپس در دماهاي 18، 22، 28، 32 و 37 درجه القا گرديد. در ادامه پس از سونيكاسيون، تخليص آنزيم‌ها با كروماتوگرافي تمايلي انجام شد. پس از تأييد بيان با SDS-PAGE، غلظت آنزيم‌هاي بيان‌شده در دماهاي القاي متفاوت با روش برادفورد اندازه‌گيري و مقايسه شد. در ادامه فعاليت آنزيم‌ها با روش رنگ‌سنجي بررسي و مقايسه گرديد. نهايتاً با روش طيف‌سنجي فلورسانس، اثر نانوذرات طلا بر ساختار آنزيم كراتيناز مورد بررسي قرار گرفت. يافته‌ها: بررسي ميزان بيان آنزيم كراتيناز در دماهاي مختلف در محيط كشت TB نشان داد كه در دماي 28 درجه، بيشترين مقدار آنزيم با بالاترين ميزان فعاليت حاصل شد. از طرفي طيف‌سنجي فلورسانس آنزيم كراتيناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا در طول موج تهييج 295 نانومتر، كاهش شدت فلورسانس در حضور نانوذرات طلا را نشان داد. نتيجه‌گيري: القاي بيان در 28 درجه‌ سانتي‌گراد در محيط كشت TB، آنزيمي فعال‌تر و غليظ‌تر ارائه مي‌دهد. همچنين نانوذرات طلا باعث كاهش شدت فلورسانس آنزيم شد كه مي‌تواند نشانگر تغيير در ريزمحيط آمينواسيد فلورسانت در ساختار آنزيم كراتيناز باشد.