شناسايي بررسي بيان برخي از microRNAهاي حفاظت شده دخيل در مسير بيوسنتز ويتانوليدها در پنيرباد (Withania somnifera)

سابقه و هدف: پنيرباد (Withania somnifera) متعلق به خانواده سيب‌زميني، به صورت يك درختچه كوچك هميشه سبز با ريشه هاي غده اي بزرگ است و در مناطق گرمسيري و نيمه‌گرمسيري وجود دارد. تركيبات اصلي پنيرباد، ويتانوليدها هستند كه شامل ويتافرينA، ويتانوليدD، ويتانوليدA و ويتانون ها مي‌باشند. ويتافرين A و ويتانون ها بيشتر در برگ هاي پنيرباد وجود دارند، در حالي‌ كه ويتانوليد Aعمدتاً در ريشه توليد مي شود. بيوسنتز اين متابوليت‌ها به ژن هاي فارنسيل پيروفسفات (FPP)، سيكلوآرتنول سنتاز (CAS)، استرول متيل ترانسفراز (SMT1) و ‌هيدروكسي متيل گلوتاريل كوآنزيم A ردوكتاز (HMGR)، مرتبط با مسيرهاي متابوليك مربوط بستگي دارد و RNAهاي غيركدكننده مانند miRNA ها در تنظيم  بيان اين ژن ها و آنزيم ها نقش دارند. ژن هاي miRNA ها، RNAهاي كوچك با طول 18- 24 نوكلئوتيد هستند كه هيچ پروتئيني كد نمي كنند و بروز ژن را در گياهان و حيوانات تنظيم مي كنند. اين گروه از RNAهاي غير رمز كننده نقش مهمي در تنظيم بيان ژن پس از رونويسي ايفا مي كنند و به‌عنوان تنظيم‌كننده هاي منفي بيان ژن در يوكاريوت ها فعاليت دارند. اين تحقيق با هدف شناسايي و بررسي بيان برخي miRNA‌هاي حفاظت شده دخيل در بيوسنتز ويتانوليدها در گياه پنيرباد اجرا گرديد.مواد و روش‌ها: در اين پژوهش، براي انجام آناليز HPLC از دستگاه كروماتوگرافي مايع با عملكرد بالا متصل به آشكارساز ELSD، مدل C-650 استفاده شد. به منظور شناسايي miRNA هاي حفاظت شده در گياه پنيرباد از داده هاي RNA-seqمبتني بر همولوژي توسط نرم‌افزار C-mii از BLASTn با معيارهاي تا چهار عدم تطابق و E- value 10 استفاده شد. ساختار ثانويه miRNAهاي متمايز به وسيله نرم‌افزار Mfold تعيين شد. ژن‌هاي هدف miRNAهاي نامزد با استفاده از psRNATarget بر اساس پارامترهاي زير شامل: E-value 1.0E^-5، تعداد جايگاه هاي مورد هدف برابر2، محدوده نداشتن بازهاي مركزي بين 10-11 نوكلئوتيد، بيشترين عدم تشابه برابر 2 و بدون هيچ گونه فاصله انتخاب گرديدند و براي پي بردن به عملكرد ژن هاي هدف از ابزارBLASTx عليه پايگاه داده پروتئيني استفاده شد. در مرحله گلدهي نمونه‌برداري از دو بافت برگ و ريشه سه ژنوتيپ W1 (7629245)،W3 (7629241) و W4 (7629244) با سه تكرار تكنيكي و سه تكرار بيولوژيكي انجام گرديد. از Real-time PCR براي ارزيابي بيان miRNA5021 و ژن هدف آن SMT1 و miRNA5140 استفاده شد و تجزيه داده هاي حاصل از بيان با استفاده از روش 2^ΔΔCT- انجام شد. يافته‌ها: با توجه به تجزيه‌هاي آماري داده هاي حاصل از HPLC، بين مقدار ويتافرين آ در سه ژنوتيپ (W1، W3 و W 4) از لحاظ آماري اختلاف معني‌داري مشاهده نشد. در بين بافت هاي مورد مطالعه بيشترين ميزان مربوط به برگ W3 و كمترين به ريشه W1 اختصاص داده شده است. براي شناسايي miRNAها ساختار دوم توالي ها با سرور mfold پيش بيني شد. حداقل انرژي آزاد پيچش (MFE) از 15- تا 130.4- kcal.mol متفاوت بود و ميانگين آن 42.98- kcal.mol محاسبه گرديد. نتايج حاصل از روش RT-qPCR نشان داد كه ميزان بيان نسبي miR5021 در ريشه W1، W3 و W4 نسبت به شاهد (بافت برگ W1)، 1.16، 1.37 و 1.17 به ترتيب افزايش بيان و در برگ W3 و W4 به ترتيب 3.1 و 3.7 برابر كاهش بيان مشاهده شد. الگوي بيان براي ژن SMT1 در سه ژنوتيپ W. somnifera براي ريشه W1، W3و W4 به ترتيب 7.7، 2.8 و 4 برابر كاهش و در برگ W3 و W4 به ترتيب 2.48 و 1.82 برابر افزايش بيان نسبت به  شاهد مشاهده شد. همچنين بيان نسبي miR5140 در برگ W3، 1.57 و براي W4 بدون تغيير و در ريشه,WI W3 و W4نسبت به شاهد به ترتيب هفت، نه و سه برابر كاهش بيان ديده شد كه طبق اناليزهاي آماري براي miRNA5021 و miRNA5140 در بين  سه ژنوتيپ براي هر يك از اين ژن ها اختلاف معني‌داري وجود ندارد.نتيجه ‌گيري: در مجموع با توجه به نقش تنظيمي miRNAهاي شناسايي شده در اين مطالعه، مي توان از اين ژن ها در شناسايي بهتر و دقيق تر مسير بيوسنتز ويتانوليدها استفاده كرد.