مقايسه‌ي عملكرد آنزيم T7 اندونوكلئاز I و سيستم الكتروفورز ژل پلي‌آكريل‌آميد در ارزيابي كارآيي برش سيستم CRIPSR/Cas9

مقدمه: ارزيابي كارآيي برش آنزيم Cas9 در سيستم CRISPR (Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat) و غربال‌گري جهش‌هاي ايجاد شده، يكي از چالش‌هاي اين سيستم مي‌باشد. اين مطالعه روشي مبتني بر استفاده از سيستم پلي‌اكريل‌آميد غيردناتوره، بدون نياز به تشكيل هترودپلكس با كارآيي بالا را پيشنهاد مي‌كند.روش‌ها: در اين مطالعه، به منظور بررسي عملكرد سيستم CRISPR-Cas9، ابتدا توالي RNA راهنماي مناسب با توالي هدف، طراحي و سنتز شد. وكتور (PX458) pSpCas9(BB)-2A-GFP با استفاده آنزيم BbsI برش داده و RNA راهنماي در جايگاه برش كلون شد. پلاسميد نوتركيب، استخراج و پس از تأييد صحت كلونينگ با استفاده از تكنيك توالي‌يابي، به رده‌ي سلولي HEK293T ترانسفكت گرديد. پس از تأييد انتقال و تعيين درصد ترانسفكت توسط دستگاه فلوسايتومتري، DNA ژنومي سلول‌هاي حامل وكتور نوتركيب استخراج شد. دو واكنش (Polymerase chain reaction) PCR مختلف در ناحيه‌ي مورد نظر بر روي ژن بتاگلوبين انجام شد و درصد عملكرد آنزيم Cas9 با استفاده از آنزيم اندونوكلئاز T7I (T7EndonucleaseI) و سيستم پلي‌اكريل‌آميد غيردناتوره كننده ارزيابي گرديد.يافته‌ها: نتايج هضم آنزيمي T7E1 بر روي ژنوم، نشان‌دهنده‌ي عملكرد 32 درصدي آنزيم Cas9 و نتايج سيستم پلي‌اكريل‌آميد غيردناتوره كننده، نشان‌دهنده‌ي عملكرد 66 درصدي آنزيم بود. به اين ترتيب سيستم پلي‌اكريل‌آميد غيردناتوره به طور قابل اعتمادي تغييرات كوچك به اندازه‌ي 5-10 جفت باز (bp) در طول اسيد نوكلئيك در محل مورد نظر را نيز تشخيص مي‌دهد.نتيجه‌گيري: تكنيك PAGE مي‌تواند جايگزين سنجش T7E1 به عنوان يك پروتكل معمول آزمايشگاهي براي ژنوتيپ كردن رده‌هاي سلولي انساني توليد شده با سيستم CRISPR/Cas9 شود.