بهينه كردن انتقال ژن نايسين به واسطه‌ي اگروباكتريوم در گياه هويج

نايسين يك آنتي‌باكتريال طبيعي است كه به عنوان نگهدارنده در مواد غذايي و داروها استفاده مي‌شود. توليد گياهچه‌ي تراريخته هويج حاوي پروتئين نوتركيب نايسين به واسطه‌ي اگروباكتريوم، سويه‌ي LBA4404 و پلاسميد pBI121 بررسي شد. پلاسميد pBI121 حاوي ژن‌هاي گزارشگر NPTIIبه ترتيب با پيشبرهايCaMV35S مي‌باشد. به منظور تهيه‌ي پلاسميد نوتركيب، ابتدا ژن نايسين از باكتري لاكتوكوكوس لاكتيس شناسايي شد. پس از بهينه‌سازي كدوني، بين دوسايت برشي BamHI و SacI در وكتورpBI121 كلون سازي شد. ريزنمونه‌هاي ريشه، برگ، ساقه و گره-ي هويج با سوسپانسيون اگروباكتريوم حاوي پلاسميد نوتركيب با غلظت‌هاي مختلف مايه تلقيحآلوده شدند و در زمان‌هاي مختلف هم‌كشتي قرار داده شدند و بعد از سه روز در محيط كشت كالوس‌زايي حاوي كانامايسين و سفاتاكسيم كشت شدند. كالوس‌هايي كه قادر به رشد روي محيط گزينش بودند، انتخاب و به محيط باززايي منتقل شدند. كالوس‌زايي در 40 درصد ريزنمونه‌ها مشاهده شد. 55 درصد كالوس‌هاي مقاوم، جنين‌زا شدند. جنين‌هاي توليد شده پس از جوانه زني به محيط باززايي منتقل شدند. بيشترين درصد گياهان مقاوم به كانامايسين (45 درصد) مربوط به استفاده ازريزنمونه-ي ساقه و غلظت باكتري 6/0 تا 8/0 و زمان‌هاي مختلف هم‌كشتي 1و 2 روز و غلظت 250 ميلي‌گرم در ليتر سفاتاكسيم بود. به منظور اطمينان از عدم آلودگي گياهان به اگروباكتريوم و تاييد صحت انتقال ژن، واكنش زنجيره‌اي پليمراز با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي Vir Gene انجام و صحت انتقال ژن تاييد شد. واكنش زنجيره اي پلي مراز نشان داد كه 60 درصد گياهان تراريخته فرضي، حداقل يك نسخه از ژن هاي nptII و نايسين را در ژنوم خود دارا هستند.