بررسي ويرايش ژن DAZL در ژنوم رويان بز بختياري با استفاده از CRISPR/Cas9 و تكنيك هاي انتقال هسته سلول سوماتيك

CRISPR/Cas9 در حال ايجاد تغييرات در مهندسي ژنوم و ويژگي هاي مختلف دام به ويژه صفات اقتصادي است. DAZL يك پروتئين حفاظت شده متصل به RNA است كه براي تمايز و توسعه سلول هاي زايا، ضروري است. نرهاي ناك اوت شده براي اين ژن، قادر به توليد اسپرم نيستند. هدف از اين مطالعه، ايجاد رويان بز ناك اوت براي ژن DAZL بود. با استفاده از gRNA طراحي شده در وكتور PX459، پلاسميدها ساخته و كلون شدند. پلاسميد نوتركيب با استفاده از روش الكتروپوريشن به سلول هاي فيبروبلاست منتقل شده و سلول هاي ترانسفكت شده با تيمار پورمايسين انتخاب شدند. سلول‌هاي ويرايش شده از مسير روند انتقال هسته سلول سوماتيك (شبيه سازي)، به تخمك‌هاي بدون هسته متصل شده و سپس، همجوشي الكتريكي غشاي سلولي اعمال شد. رويان هاي حاصل از روند شبيه سازي از نظر مراحل روياني و رسيدن به مراحل تسهيم و بلاستوسيست بررسي شدند. نتايج بررسي بيان ژن، موفقيت تكنيك CRISPR/Cas9 براي سركوب ژن DAZL را نشان داد. نرخ تكوين بلاستوسيت حاصل از روند شبيه سازي با سلول هاي ناك اوت شده، تفاوت قابل توجهي با گروه شاهد نداشت. با كمك بررسي توالي يابي ژنتيكي، ميزان ناك اوت ژن DAZL در سلول فيبروبلاست، 83.3 و در بلاستوسيست‌هاي حاصل از شبيه سازي، 55.3 درصد به دست آمد. جهش ها از نوع INDEL و همگي به شكل تغيير قالب خوانش پروتئين بودند كه منجر به تغيير پروتئين مي شود. بلاستوسيت‌هاي توليد شده را مي توان براي انتقال به حيوان گيرنده و توليد بزهاي ناك اوت شده براي ژن DAZL براي مطالعات بيشتر و بهينه ‌سازي پيوند سلول هاي بنيادي اسپرماتوگونيال استفاده كرد.