همسانه‌سازي، شناسايي و بررسي بيان ژن stylopine synthase (STS) در ماميران كبير (Chelidonium majus)

سابقه و هدف:سنگوئينارين (Sanguinarin) يكي از متابوليت‌هاي ثانويه مهم از خانواده آلكالوئيدهاي گروه بنزيل ايزوكوئينولين مي‌باشد كه به‌طور گسترده در بيشتر گياهان خانواده پاپاوراسه(Papaveraceae) ازجمله ماميران كبير (Chelidonium majus) وجود دارد. سنگوئينارين داراي خواص بسياري مانند خاصيت ضد ميكروبي قوي، ضدقارچي و ضدالتهاب است. كاربرد محرك هاي غيرزنده يكي از راهكارهاي مؤثر القاي توليد و افزايش متابوليت هاي ثانويه مي باشد. محرك هايي مانند متيل‌جاسمونات از طريق تحريك سيستم دفاعي گياه موجب القاء بيوسنتز و انباشت متابوليت‌هاي ثانويه مي‌شوند. ازآنجايي ‌كه گزارشي مبني بر جداسازي cDNA كدكننده ژن STS در مسير بيوسنتز آلكالوئيد سنگوئينارين در گياه ماميران وجود ندارد، در اين تحقيق اقدام به جداسازي طول كامل اين ژن گرديد تا فرصتي براي شناسايي و بررسي مسيرهاي بنزيل‌ايزوكويينولين ‌كه تاكنون شناخته نشده‌اند فراهم گردد. همچنين، پس از جداسازي ژن مذكور، الگوي بياني اين ژن تحت تأثير محرك غيرزنده متيل جاسمونات در جهت بهبود توليد آن بررسي شد.مواد و روش ها:در اين تحقيق، در مرحله اول شناسايي و جداسازي cDNA كدكننده ژن stylopine synthase (STS) از اندام ريشه گياه ماميران كبير انجام شد. اين ژن يكي از ژن‌هاي مسير توليد سنگوئينارين مي‌باشد و واكنش تبديل (S)-Cheilanthifoline به (S)- Stylopine در پل متيلوكسي را سنتز مي‌كند كه متعلق به زير خانواده CYP719 است. در مرحله بعدي ميزان بيان ژن STS با اعمال تيمار متيل جاسمونات با غلظت 100 ميكرومولار در چهار سطح (محلول‌پاشي، آبياري، تركيب محلول‌پاشي+ آبياري و شاهد بدون متيل جاسمونات) در اندام‌هاي مختلف (برگ، ريشه و ساقه) اين گياه در زمان‌هاي مختلف پس از تيمار (6، 24 و 48 ساعت) در قالب طرح پايه كاملاً تصادفي در چهار تكرار در شرايط گلخانه‌اي بررسي شد.نتايج: جداسازي cDNA ژن STS در دو مرحله انجام شد. ابتدا توالي ناقص (1000 جفت باز) جداسازي شد و بعد با طراحي آغازگرهاي جديد بر اساس اطلاعات بدست آمده از توالي اوليه، طول كامل ناحيه كدكننده ژن استيلوپين‌سنتاز (1500 جفت باز) جداسازي و با موفقيت در پلاسميد pTG19-T همسانه‌سازي شد. پس از توالي‌يابي و انجام اصلاحات لازم، توالي ژني به‌دست ‌آمده با شماره دسترسي KY550671.2 در پايگاه اطلاعاتي NCBI ثبت گرديد. با بررسي خصوصيات توالي و مطالعه روابط فيلوژنتيكي، مشخص شد كه CYP719A3 حاصل فعاليت ژن STS (ژن همسانه‌سازي و توالي يابي شده) متعلق به خانواده پروتئيني P450 است. نتايج تجزيه واريانس بيانگر اثر معني‌دار تيمار متيل ‌جاسمونات در زمان‌هاي مختلف در بافت‌هاي متفاوت بر بيان ژن STS گياه ماميران (در سطح P≤0.01) بود. بيشترين ميزان بيان ژن STS در تيمار تركيب محلول‌پاشي+ آبياري با متيل ‌جاسمونات در زمان 48 ساعت پس از اعمال تيمار در اندام ريشه بود. مقايسه ميانگين بيان نسبي ژن STS نشان داد كه ميزان بيان اين ژن در ريشه، برگ و ساقه ماميران كبير متفاوت بود، به‌طوري‌كه در ريشه 1.5 برابر برگ و 2.5 برابر ساقه بود. بيان بالاي ژن STS در ريشه ماميران نشان‌دهنده مؤثر بودن اندام گياهي در ميزان فعاليت ژن مي باشد و از سوي ديگر كاربرد محرك متيل ‌جاسمونات مي تواند نقش مؤثري در افزايش بيان آن داشته باشد.نتيجه گيري: متيل‌ جاسمونات سبب افزايش بيان ژن STS در مسير بيوسنتزي سنگوئينارين شد، به‌طوري‌كه بيشترين افزايش بيان در ريشه گياه ماميران مشاهده گرديد. ازاين‌رو، توالي ژن كدكننده STS در مسير بيوسنتز سنگوئينارين و الگوي بياني آن در گياه ماميران كبير مي‌تواند در زمينه مهندسي مسير اين متابوليت ارزشمند استفاده شود.