تأثير اندازه ريزنمونه بر توليد زيست توده و ويژگي‏ هاي كالوس در كشت درون شيشه ‏اي سرخدار اروپايي (Taxus baccata L.) و اقيانوس آرام (T. brevifolia Nutt.)

سابقه و هدف:پاكلي‌تاكسل يكي از پرمصرف‌ترين داروها در درمان سرطان است كه در مقادير بسيار كم (0.01 – 0.03 درصد وزن خشك) در پوست درختان نادر گونه‏هاي Taxus وجود دارد. امروزه موفقيت در كشت و توليد كالوس‏هاي با كميت و كيفيت در شرايط درون‌شيشه‌اي‌ به منظور توليد حداكثري متابوليت‌هاي ثانويه دارويي و جلوگيري از انقراض گونه‏هاي گياهي ارزشمند از اهميت ويژه‏اي برخوردار است. در اين راستا، اندازه ريزنمونه كشت بافتي به دليل تعيين توانايي بازتوليدي، تأثير قابل ملاحظه‎اي بر ميزان زيست‌توده كالوس و كيفيت آن دارد. از اين‌رو، اين پژوهش با هدف معرفي اندازه بهينه‌ ريزنمونه‌هاي ساقه دو گونه سرخدار اروپايي و اقيانوس آرام در توليد كالوس با كميت و كيفيت بيشتر انجام شد.مواد و روش‌ها در اين تحقيق، از بافت ساقه دو گونه سرخدار Taxus baccata و T. brevifolia به عنوان ريزنمونه براي كشت بافت و توليد كالوس استفاده شد. ريزنمونه‏هاي ساقه هر دو گونه سرخدار پس از حذف قسمت انتهايي برگ‌ها، به صورت مجزا در پنج گروه با اندازه‌هاي 2–1.5، 2.5–2، 3–2.5، 3.5–3 و 4–3.5 سانتي‏متر تهيه شدند. كليه ريزنمونه‏ها پس از ضدعفوني با اتانول (70 درصد)، هيپوكلريت سديم (1.5 درصد) و آنتي‏بيوتيك سفوتاكسيم (200 ميلي‏گرم در ليتر)، روي محيط كشت B5 جامد كشت و در اتاق رشد در دماي 25 درجه سانتي‌گراد و تاريكي نگهداري شدند. صفات مورد مطالعه شامل ميزان زيست‌توده كالوس توليدي به تفكيك گونه و اندازه ريزنمونه، 28 روز پس از كشت ريزنمونه‏ها ارزيابي شد. همچنين ويژگي‏هاي مورفولوژيك كالوس‌هاي حاصل از هر گونه شامل نوع بافت كالوس‌ با سه ساختار پنبه‌اي، نرم و مخلوط (تركيبي از پنبه‌اي و نرم)، رنگ كالوس‌ شامل سفيد، قهوه‌اي و مخلوط (تركيبي از سفيد و قهوه‌اي) بررسي گرديد. شدت ترشح تركيبات فنولي براساس شدت رنگ در محيط كشت از صفر تا پنج (فاقد، خيلي‌كم، كم، متوسط، زياد و خيلي‌زياد) امتيازدهي شد. آزمايش به صورت فاكتوريل با دو عامل گونه در دو سطح و اندازه ريزنمونه در پنج سطح در قالب طرح پايه كاملاً تصادفي اجرا شد. تجزيه آماري با استفاده از روش‏هاي تجزيه واريانس و مقايسه ميانگين با آزمون دانكن براي داده‌هاي كالوس‌زايي و آزمون كاي‏اسكور براي داده‌هاي تركيبات فنولي انجام شد. همچنين از همبستگي پيرسون به منظور ارزيابي ارتباط بين اندازه ريزنمونه و زيست‌توده و تركيبات فنولي استفاده شد.يافته‌هابراساس نتايج، كالوس‌هاي حاصل از ريزنمونه‌هاي با طول كمتر از 2.5 سانتي‌متر در گونه T. brevifolia داراي 33% وزن تر بيشتري در مقايسه با T. baccata بود. افزايش طول ريزنمونه از 2–1.5 به 3–2.5 سانتي‌متر سبب افزايش 2.6 برابري زيست‌توده كالوس گونه  T. baccataو 1.5 برابري در T. brevifolia شد. ترشح تركيبات فنولي نيز در ريزنمونه‌هاي با طول كمتر از 2.5 سانتي‌متر در گونه  T. brevifolia14 درصد كمتر از T. baccata مشاهده شد. با افزايش طول ريزنمونه‏ها به 3–2.5، 3.5–3 و 4– 3.5 سانتي‌متر ترشح تركيبات فنولي به ترتيب 4، 6 و 15% در T. brevifolia در مقايسه با T. baccata بيشتر بود. نتايج نشان داد، كالوس‌هاي حاصل از ريزنمونه‌هاي T. baccata و T. brevifolia به ترتيب داراي 82 و 27% بافت پنبه‌اي، 2 و 52% بافت نرم و 16 و 21%  بافت مخلوط بودند. بيشترين درصد كالوس‌هاي سفيد رنگ با 63% كالوس به T. baccata تعلق داشت و بافت مخلوط و قهوه‌اي به ترتيب در %30 و 7% از كالوس‏ها مشاهده شد. در حالي ‌كه تنها 37% از كالوس‌هاي  T. Brevifoliaسفيد رنگ بودند و 33% و 30% به ترتيب مخلوط و قهوه‌اي رنگ بودند. نتايج همچنين حكايت از وجود همبستگي متوسط 0.57 و 0.40 به ترتيب بين اندازه ريزنمونه با زيست‌توده توليدي در گونه T. baccata و T. brevifolia از يكسو و همبستگي ضعيف 0.23 و 0.25 بين اندازه ريزنمونه با شدت ترشح تركيبات فنولي در دو گونه مورد مطالعه داشت. نتيجه‌گيرينتايج نشان داد امكان افزايش معني‏دار زيست‌توده كالوس با كمترين ميزان تركيبات فنولي از ريزنمونه‏هاي ساقه دو گونه سرخدار با افزايش طول معين در اندازه ريزنمونه ميسر است. همچنين با در نظر گرفتن زيست‌توده توليدي و ويژگي‌هاي كالوس مشخص شد كه طول 2.5–2 سانتي‌متر به دليل توليد زيست‌توده كالوس بيشتر از يكسو و ترشح تركيبات فنولي كمتر از سوي ديگر به عنوان بهينه اندازه ريزنمونه ساقه در كشت بافت دو گونه مورد مطالعه پيشنهاد شد.