بهينه‌ سازي شرايط كشت درون شيشه‌اي زالزالك خونين (Crataegus atrosanguinea)

مقدمه و هدف: پژوهش در زمينه حفاظت از ژرم‌ پلاسم گونه‌هاي درختي بومي و دارويي جنگل‌هاي شمال ايران به ‌ويژه زالزالك خونين با خواص دارويي فراوان، داراي اهميت است. تكثير جنسي زالزالك به دلايل پوسته ضخيم و دو نوع خفتگي فيزيكي و فيزيولوژيك به‌سختي و با آپوميكسي امكان‌پذير است و تكثير غيرجنسي آن از راه ريشه‌دار كردن قلمه نيز با مشكلات فراواني مواجه است. زالزالك خونين (Crataegus atrosanguinea) از خانواده Rosaceae يكي از گونه‌هاي با ارزش جنگل‌هاي شمال و غرب كشور محسوب مي‌شود كه به‎‌دليل مثمر بودن و داشتن چوب بسيار محكم و خواص دارويي متعدد داراي اهميت فراوان است. خواص دارويي زالزالك در درمان فشار خون، تصلب شرائين و احتقان قلب، ضعف عضلات قلب و نارسايي كرونر به اثبات رسيده است. زالزالك حاوي متابوليت‌هاي ثانويه فراوان مانند فلاونوئيدها و پروآنتوسيانيدين و گيلكوزيدها است. بهينه‌سازي شرايط كشت درون شيشه‌اي زالزالك خونين به‌عنوان يكي از گونه‌هاي طبيعي ايران مي‌تواند راهكار مناسبي براي تكثير آن باشد. پژوهش حاضر با هدف كنترل آلودگي، كنترل قهوه‌اي‌شدن و القاي كالوس زالزالك خونين (Crataegus atrosanguinea) در شرايط درون شيشه‌اي انجام شد. كنترل آلودگي ريزنمونه، بذر و بافت گياهان از اهميت بالايي براي موفقيت كشت بافت گياهان محسوب مي‌شود. از آنجا كه پرآوري از ريزنمونه‌هاي طبيعي گياهان براي كشت بافت در اولويت قرار دارد، معمولاً اين مهم با قهوه‌اي شدن به‌ويژه براي گياهان چوبي كه داراي ساقه ضخيم و چوبي هستند با مشكلات فراواني همراه است. تعيين نوع و غلظت تنظيم‌كننده رشد به‎عنوان يك عامل متغير براي رشد گياهان در شرايط درون شيشه‌اي ضروري است. بعد از اعمال تنظيم‌كننده رشد به محيط كشت، گياه واكنش‌هاي مختلفي نشان خواهد داد اما يكي از راه‌هاي مناسب براي انتخاب مسير صحيح باززايي گياهان، تعيين وزن تر و خشك كالوس است كه به‎طور گسترده به‌عنوان معياري از رشد كالوس‌ها مورد اندازه‎گيري قرار مي‎گيرد. با استفاده از وزن تر و خشك كالوس مي‌توان منحني رشد كالوس را به‌دست آورد. نتايج پژوهش‌هاي گذشته حاكي از دامنه وسيع تغييرات نوع و غلظت تنظيم‌كننده رشد بر كالوس‌زايي و باززايي گونه‌هاي مختلف جنس زالزالك است و متناسب با نوع گونه گياهي بايد نوع و غلظت خاصي از تنظيم‌كننده‌هاي رشد را اعمال كرد. مواد و روش‌ها: ساقه‌هاي جوان و سالم زالزالك‎ خونين از لاريجان آمل، استان مازندران، ايران با مختصات جغرافيايي ’38° 58 شمالي و ’10° 52 شرقي در ابتداي فصل رويش جمع‌آوري شد. ساقه‌هاي جمع‌آوري شده بلافاصله به آزمايشگاه كشت بافت گياهي دانشكده منابع طبيعي در دانشگاه كشاورزي و منابع طبيعي ساري، ايران منتقل شدند. ضدعفوني ساقه‌هاي طبيعي زالزالك به‎دليل آلودگي سطحي و بافتي فراوان بسيار ضروري است. براي اين‎منظور از ساقه‌ها ريزنمونه‌هايي به اندازه 0/5 تا يك سانتي‌متري برش داده شدند. تيمارهاي كنترل آلودگي شامل HgCl2، H2O2، NaClO و AgNO3 و همچنين براي كنترل قهوه‌اي شدن ريزنمونه‌ها پنج تيمار طراحي شد. تيمارهاي كنترل قهوه‌اي شدن شامل شاهد، آب روان، اسيداسكوربيك، پلي‌وينيل‌كلرايد و ذغال فعال بود. به‌طور كلي محيط ‌كشت از موادي شامل نمك‌هاي معدني (عناصر كم مصرف و پر مصرف) به‌عنوان تأمين كننده رشد بيشينه، اسيدهاي آمينه و ويتامين‌ها به‎عنوان نيتروژن، قند به‎عنوان منبع كربن و انرژي، تنظيم‌كننده‌هاي رشد به‎عنوان محرك رشد و ريخت‌زايي، آگار به‎عنوان جامد كننده محيط‌ كشت و آب كه 90 درصد محيط‌ كشت را شامل مي‌شود، تشكيل مي‌گردد. محيط‌كشت به‎كار رفته در اين تحقيق MS بود كه اولين بار توسط درايور و كنياكي در سال 1984 ساخته شد و با در نظر گرفتن روش دوفوسارد1976 تهيه شد. در اين پژوهش pH محيط كشت روي 5/8 تنظيم گرديد. براي القاي كالوس، تيمارهاي IBA، NAA، 2,4-D، BAP، TDZ و Kin در سه سطح غلظت 0/1، 1 و 6 ميلي‌گرم در ليتر و تركيب 6 mgl-1 NAA+1 mgl-1 BAP و 6 mgl-1 IBA+1 mgl-1 BAP در محيط كشت MS استفاده شد. در اين مطالعه ريزنمونه‌هاي ساقه به‎صورت افقي روي محيط‌كشت قرار گرفتند. از بين تيمار‌هاي مختلف كالوس‌زايي براي بررسي القاي كالوس، درصد كالوس‌زايي، درجه كالوس‌زايي، وزن تر و خشك كالوس و مساحت سطح مقطع كالوس اندازه‌گيري شد. بهترين تيمار از طريق محاسبه مشخصه‌هاي مذكور به‌دست آمد و براي واكشت از آن تيمار استفاده مي‌شد. به‌طور تقريبي هر 20 روز و در مجموع پنج الي شش بار واكشت انجام گرفت. بعـد از كشـت كالوس‌ها در محيـط باززايـي، ريزنمونه‌ها در اتاقك كشت و قفسه‌هاي سازگاري تحت تيمار 16 ساعت روشنايي و 8 ساعت تاريكي در دماي 2± 25 درجه سانتي‌گراد با رطوبت 70 درصد قرار گرفتند. يافته‌ها: نتايج نشان داد كه HgCl2 (0/5 درصد، 16 دقيقه) با ميانگين 100 درصد سلامت به‌عنوان مناسب‌ترين تيمار كنترل آلودگي بود. تيمار شاهد با 98 درصد سلامت به‌عنوان مناسب‌ترين تيمار كنترل قهوه‌اي‌شدن مشاهده شد. همچنين نتايج نشان داد كه نوع، غلظت و اثر متقابل نوع و غلظت تنظيم‌كننده رشد بر مشخصه‌هاي القاي كالوس زالزالك خونين اثر معني‌داري دارد (P 0.01). بيشترين وزن تر و خشك كالوس، درصد و درجه كالوس‌زايي و سطح مقطع كالوس در بين تيمارهاي اكسين و سيتوكنين به‌ترتيب براي تيمارهاي 6 ميلي‌گرم در ليتر NAA و تيمار 1 ميلي‌گرم در ليتر BAP مشاهده شد. همچنين نتايج نشان داد كه بيشترين مقدار مشخصه‌هاي القاي كالوس مورد مطالعه در محيط كشت حاوي تركيب اكسين و سيتوكنين (6 mgl-1 IBA+1 mgl-1 BAP) مشاهده گرديد. نتيجه‌گيري كلي: به‌طور كلي نتايج نشان داد كه در حالت عادي و بدون اعمال هيچ تيماري تا 90 درصد احتمال كنترل قهوه‌اي شدن ريزنمونه‌هاي سرشاخه‌هاي طبيعي زالزالك خونين وجود دارد. براي ضدعفوني ريزنمونه‌ها استفاده از كلريد جيوه نيم‎درصد به‌مدت 16 دقيقه پيشنهاد مي‌شود. تركيب تنظيم‌كننده‌هاي رشد در محيط كشت براي القاي كالوس زالزاك خونين بسيار مناسب ارزيابي شد. ارائه نتايج اين پژوهش مي‌تواند دستورالعمل آزمايشگاهي براي باززايي و پرآوري زالزالك خونين فراهم كند.