جداسازي و بررسي خصوصيات باكتريوفاژهاي ليتيك موثر جهت كنترل عفونت‌هاي حاصل از باكتري‌هاي كلبسيلا پنومونيه مقاوم به آنتي‌بيوتيك در شمال غرب ايران

سابقه و هدف: با ظهور باكتري‌هاي مقاوم به آنتي‌بيوتيك، يافتن مواد ضد‌ميكروبي جايگزين موثر براي مبارزه با اين باكتري‌ها اجتناب‌ناپذير مي‌باشد. باكتريوفاژ‌درماني به‌عنوان يك رهيافت بيولوژيك داراي پتانسيل درماني بالا اخيرا در اين زمينه مورد توجه قرار گرفته است. اين مطالعه با هدف جداسازي باكتريوفاژهاي ليتيك عليه ‌جدايه‌هاي باليني كلبسيلا پنومونيه داراي مقاومت‌هاي چندگانه آنتي‌بيوتيكي و ارزيابي خصوصيات زيستي و شكلي آن‌ها به‌عنوان كانديداهايي براي فاژ درماني، انجام پذيرفت.مواد و روش‌ها: در اين مطالعه توصيفي- مقطعي، جدايه‌هاي باليني به‌دست آمده از بيمارستان شهيد مدني شهر تبريز با استفاده از تست‌هاي استاندارد بيوشيميايي به‌عنوان كلبسيلا پنومونيه تاييد شدند و سنجش حساسيت آنتي‌بيوتيكي آن‌ها با استفاده از روش استاندارد انتشار از ديسك انجام شد. سپس جداسازي باكتريوفاژهاي ليتيك عليه 16 جدايه باكتريايي مقاوم به آنتي‌بيوتيك صورت گرفت. به‌طور خلاصه نمونه‌هاي آب اخذ شده جهت جداسازي فاژ از فاضلاب سانتريفيوژ گرديد. مايع رويي با فيلتر 0.45 ميكرومتر فيلتر شد و با محيط كشت تريپتون سوي براث تازه و سولفات منيزيم مخلوط شد و در دماي اتاق انكوبه‌گرديد. سپس محلول موردنظر با كلروفورم مخلوط شده و ارزيابي توليد پلاك با استفاده از روش آگار دو لايه انجام شد. ژنوم باكتريوفاژ با استفاده از آنزيم‌هاي HindIII و EcoRV تحت روند آناليز مولكولي قرار گرفت. تعيين طيف ميزباني فاژهاي جداسازي شده با استفاده از روش نقطه‌اي و آگار دو لايه انجام گرفت. سه باكتريوفاژ داراي طيف ميزباني وسيع‌تر براي بررسي بيش‌تر خصوصيات آن‌ها انتخاب شدند. منحني رشد يك مرحله‌اي فاژها ترسيم گرديد و زمان نهفته و سايز انفجاري آن‌ها مشخص شد سپس پايداري و زنده ماني باكتريوفاژهاي ليتيك در برابر دماهاي مختلف (20، 37-، 50 درجه سلسيوس)، محدوده‌هاي مختلف pH (3، 4، 5، 7، 9، 11و12) و هم‌چنين تشعشع UV بررسي گرديد. در نهايت خصوصيات شكلي باكتريوفاژ داراي بيش‌ترين طيف ميزباني (PKpMa20.2) با استفاده از ميكروسكوپ الكتروني مشخص شد.يافته‌ها: 36 جدايه باليني باكتريايي براساس تست‌هاي استاندارد بيوشيميايي به‌عنوان كلبسيلا پنومونيه تاييد تشخيص شدند. در آزمايش سنجش حساسيت آنتي‌بيوتيكي باكتري‌ها به ترتيب بيش‌ترين و كم‌ترين مقاومت آنتي‌بيوتيكي نسبت به سفازولين (80 درصد) و توبرامايسين (26 درصد) مشاهده گرديد. سپس جداسازي باكتريوفاژها عليه همه 16 جدايه منتخب با موفقيت انجام شد. بعد از استخراج ژنوم فاژهاي جدا شده تنوع توالي بالايي مشخص گرديد. در مورد تعيين طيف ميزباني، PKpMa20.2 داراي اثر كشندگي روي 11 جدايه از 16 جدايه مذكور بود. در مطالعه منحني رشد يك مرحله‌اي سه فاژ داراي طيف ميزباني بيش‌تر، زمان نهفته سه فاژ جداشده به‌ترتيب 10، 10 و 15 دقيقه و سايز انفجاري آن‌ها به ترتيب 350، 210 و 180 براي PKpMa20.2، P8 و P10 ارزيابي گرديد. هر سه فاژ پايداري خوبي در دماي بين 20- و 37 درجه سلسيوس نشان دادند. در دماي 50 درجه سلسيوس اثر ليتيك فاژ PKpMa20.2 بيش‌تر از دو فاژ ديگر بود. فاژ PKpMa20.2 در بازه pH بين 3 تا 12 فعال بود در حالي كه دو فاژ ديگر در ميزان pH برابر با 3 كاملا از بين رفتند. در بررسي ميكروسكوپ الكتروني، باكتريوفاژ PKpMa20.2 يك دم كوتاه با طول 10 نانومتر و يك سر با قطر 60 نانومتر داشت كه احتمالا متعلق به خانواده پودوويريده بود. استنتاج: با توجه به اثرات ليتيك مناسب و نيز زمان نهفته و سايز انفجاري خوب سه فاژ منتخب جدا شده در اين مطالعه به خصوص (PKpMa20.2) و هم‌چنين پايداري مناسب آن‌ها در برابر دماهاي مختلف و محدوده pH مختلف و نيز تشعشع UV، اين فاژها مي‌توانند به‌عنوان كانديدا جهت استفاده در فاژ درماني براي كنترل سويه‌هاي مقاوم كلبسيلا پنومونيه عفوني مورد توجه قرار گيرند، اما جهت استفاده درماني نياز به تجزيه و تحليل مولكولي بيش‌تري مي‌باشد.