افزايش پايداري دمايي پروتئاز ساليني ويبريو پروتئوليتيكوس AF 2004 با استفاده از جهش زايي هدفمند مكاني

روش‌هاي جهش‌زايي هدفمند مكاني، يكي از موثرترين روش‌ها در بهبود فعاليت و پايداري آنزيم‌هاي صنعتي است. در مطالعه حاضر، اثر جايگزيني آمينواسيد آلانين 56 به ايزولوسين، بر پايداري دمائي متالوپروتئاز توليد شده توسط يك باكتري نسبتا هالوفيل به نام ساليني‌ويبريو پروتئوليتيكوس بررسي شد. به منظور تهيه سويه جهش يافته مورد نظر، از پرايمرهاي جهش‌زا (موتاژنيك) و سپس تيمار با آنزيم محدود الاثر Dpn I استفاده شد. ژن جهش يافته حاصله در سازه بياني pQE80L، به سويه‌هاي بياني مختلف اشريشيا كلاي (مانند سويه‌هاي XL1 Blue، BL21(DE3) pLysS و Top10) ترنس‌فورم شد. سپس بيان آنزيم نوتركيب تحت شرايط مختلف كشت، بهينه‌سازي گرديد. آنزيم جهش يافته و آنزيم طبيعي، از ژل زيموگرافي استخراج شدند. در نهايت، پايداري دمائي و فعاليت آنزيم جهش يافته و آنزيم طبيعي، بررسي شد. حداكثر ميزان بيان آنزيم، با استفاده از سويه ميزباني E.coli BL21 (DE3) pLysS ، در محيط‌كشت Terrificبراث، در حضور IPTG 1 ميلي مولار و بعد از 24 ساعت انكوباسيون در دماي°C37، به دست آمد. آنزيم طبيعي و جهش يافته، به ترتيب حدود 42 و 24 درصد از فعاليت خود را بعد از انكوباسيون در دماي °C70 به مدت 20 دقيقه از دست دادند. از طرفي، فعاليت آنزيم جهش يافته نسبت به آنزيم طبيعي، حدود 11 درصد بيشتر بود. بنابراين، فعاليت و پايداري دمائي متالوپروتئاز باكتري ساليني‌ويبريو پروتئوليتيكوس جهش يافته (جايگزيني آلانين 56 به ايزولوسين) نسبت به آنزيم طبيعي بهبود يافت.