ثرويتريفيكاسيون بر زنده‌ماني بذور L. Medicago polymorpha نگهداري شده در شرايط فراسرد

Effect of Vitrification on Survival of Medicago polymorpha L. Cryopreserved Seeds

در اين پژوهش براي دستيـابي بـه روشي موفـق جهت نـگهداري طولاني مدت بـذور در شرايط دمـاي فـراسرد از روش ويتريفيكاسيون استفاده شد. بدين منظور از بذور يونجه يكسالهMedicago polymorpha L. كه در دماي ?C4 سازگاري سرمايي يافته بودند استفاده گشت. بذور با قرار گرفتن در مجاورت سيليكاژل در دسيكاتور براي 4 روز آبگيري شدند. سپس جهت حفاظت اسمزي به مدت 20 دقيقه در دماي °C25 با محلول گليسرول M2 در ساكاروز M 6/0 بارگيري گشتند. بذور بارگيري شده به منظور دهيدراتاسيون و حفاظت به كرايوويال‌هاي حاوي ml 5/0 محلول PVS2 صفر درجه سانتي‌گراد انتقال يافته و بلافاصله در نيتروژن مايع ذخيره شدند. كرايوويال‌هاي حاوي نمونه پس از يك هفته از نيتروژن مايع خارج گشتند و بلافاصله در حمام آبي C°37 به مدت 2 دقيقه گرمادهي شدند. در مرحله بعد به منظور آبدهي و شستشوي مواد نگهدارنده به ترتيب به مدت 5، 10 و 15 دقيقه در دماي °C 22 در داخل محلول شستشوي حاوي سوكروز M 2/1 در نمك‌هاي محيط كشت MS قرار گرقتند. بازيابي نمونه‌ها به سه روش صورت گرفت: (الف و ب) قرار دادن بذور به مدت نيم ساعت و 24 ساعت در زير آب جاري و سپس انتقال آنها بر روي پتري‌ديش‌هاي حاوي كاغذ صافي مرطوب به منظور توليد دانه‌رست، (ج) استريل بذور با استفاده از هيپوكلريت سديم 2% و سپـس انتقال آنها به محيـط كشت جامد MS حاوي mg/lit 5/0 GA3. درصد زنده‌ماني بذور نگهداري شده در دماي فراسرد در روش‌هاي بازيابي الف و ب (به ترتيب 37/94% و 21/98%) در سطح 5% با شاهد (بذوري كه تحت تيمار فراسرد قرار نگرفتند) داراي اختلاف بود درحاليكه، اين اختلاف در روش ج (زنده‌ماني 16/76%) فاقد اختلاف معني‌دار بود.

In this research a new method for long term conservation of Medicago polymorpha seeds was developed by using cryopreservation. Two year cold acclimated seeds, collected from Iran rangelands, were desiccated using silica gel for four days and then cryopreserved by vitrification method. Seeds were loaded by loading solution containing 2 M glycerol and 0.6 M sucrose for 20 min and then inserted into cryo-vials containing 0.5 ml PVS2 in 0 °C prior to direct immersed into liquid nitrogen. Seeds were kept in liquid nitrogen for a week then thawed in 37 °C water bath for 2 min. The seeds were rehydrated and detoxified in a solution of MS medium salts containing 1.2 M sucrose respectively for 5, 10 and 15 min in 22 °C. At the final stage of post-treatment, three different procedures were used: (a,b) placing seeds under running water for 30 min and 24 h before being transferred to petri-dishes containing moist filter paper, (c) sterilization of seeds with 2% hypochloride then placed on MS medium containing 0.5 mg/lit GA3. Germination percentage of cryopreserved seeds in all three post-treatments was higher than control (not cryopreserved seeds). This figure was respectively 94.37% and 98.21% for cryopreserved seeds of post-treatments a and b which was different at 0.05 levels with controls. However, germination percentage (76.16%) of cryopreserved seeds in post-treatment c showed no significant difference with control.