توسعه روش NASBA-ELISA براي تشخيص HIV-1 RNA

Development of NASBA-ELISA technique for detection of HIV-1 RNA

چكيده سابقه و هدف با شروع عفونت HIV-1 ، اولين ماركري كه در خون آشكار مي‌شود، RNA ويروسي مي‌باشد. از ميان روش‌هاي موجود كه شناسايي RNA را هدف قرار مي‌دهند؛ متداول‌ترين روش‌ها NASBA و RT-PCR هستند. NASBA مزيت‌هاي متعددي نسبت به RT-PCR ارايه مي‌كند. در اين پژوهش، واكنش NASBA در تركيب با روش آشكارسازي آسان و حساس الايزا، براي تشخيص و آشكارسازي HIV-1 RNA مورد استفاده قرار گرفت. مواد و روش‌ها نوع مطالعه انجام شده از نوع بنيادي ـ كاربردي بود. با وارد كردن نوكليوتيد 11-dig-UTP در مخلوط واكنش NASBA، RNA نشاندار توليد شد. آن‌گاه محصولات نشاندار NASBA در فاز مايع به يك پروب اختصاصي متصل به بيوتين هيبريد شدند. سپس هيبريدهاي حاصل به يك پليت پوشيده شده با استرپتواويدين منتقل شده، پس از اعمال شستشوها و خارج كردن محصولات غير اختصاصي از محيط واكنش، آشكارسازي نهايي با اضافه كردن كونژوگه آنتي ديگوكسي ژنين ـ آنزيم و سوبستراي آن صورت گرفت. يافته‌ها نتايج به دست آمده نشانگر كارآيي واكنش NASBA در تكثير ناحيه مورد نظر از ژنوم ويروس بود و آشكارسازي محصولات NASBA بر روي ژل آگاروز منحصراً يك باند 176 نوكليوتيدي مربوط به هدف را نشان مي‌داد. با به كارگيري روش الايزا در آشكارسازي محصولات NASBA ، براي غلظت 01/0 مايكرو مولار پروب، OD برابر با 11/0 ± 049/1 به دست آمد. نتيجه گيري در اين مطالعه با به كارگيري آغازگر و پروب مناسب، روش تشخيصي NASBA-ELISA با حساسيت و اختصاصيت بالا براي HIV-1 راه‌اندازي شد.

Viral RNA is the first blood marker which appears in HIV-1 infection. RT-PCR and NASBA are the commonly used techniques for amplification of RNA. NASBA technique provides more advantages over RT-PCR. In this study, an NASBA assay combined with an easy, sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed for detection of HIV-1 RNA. Materials and Methods 11 -dig-UTP was added to an NASBA reaction mixture and the RNA amplicons were labeled. Then, the dig-labeled NASBA products hybridized to a biotinylated specific probe in hybridization solution buffer and the hybrids were transferred to a streptoavidin-coated plate. After several washing processes and emission of nonspecific products, the final detection of the captured RNA was done by addition of anti-dig antibody-enzyme conjugate and the substrate.Results The results demonstrated that, NASBA is an efficient method for amplification of the target genome. Detection of NASBA products by agarose gel electrophoresis showed a unique 176 bp band corresponding to the specific target. For the detection of NASBA products, an ELISA assay was performed; using 0.01 \iM probe, the OD of 1.049 ±0.11 was obtained. Conclusions In this study, by using suitable primers and probe a highly sensitive and specific NASBA- ELISA method for detection of HIV-1 developed.