تشخيص مولكولي گونه هاي Mycosphaerella ايجادكننده بيماري مركب سيگاتوكا با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي

Molecular Detection of Mycosphaerella spp. Involved in Sigatoka Disease of Banana using Species-Specific Primer Sets

بيماري سيگاتوكاي موز يك بيماري مركب مي‎باشد كه سه گونهM. musicola, M. fijiensis و M. eumusae بعنوان عوامل اوليه ايجادكننده اين بيماري به شمار مي‎روند. شناسايي كلاسيك اين سه گونه به خاطر همپوشاني علايم بيماري، عدم وجود تفاوت مورفولوژيك بارز در مرحله تليومورف و عدم اسپورزايي آنها روي محيط‎هاي كشت مصنوعي مشكل مي‎باشد. پراكنش دقيق گونه هاي فوق و اپيدميولوژي اين بيماري هنوز به طور كامل مشخص نگرديده است. علاوه بر اين، دو گونه M. fijiensis و M. eumusae در بسياري از كشورهاي توليدكننده موز حضور نداشته و گونه‎هاي قرنطينه اي به حساب مي‎آيند. بنابراين، شناسايي سريع و دقيق آنها جهت به كار گيري استراتژي مناسب مديريتي ضروري به نظر مي‎رسد. در تحقيق حاضر آغازگر هاي اختصاصي براي هريك از گونه‎هاي فوق بر اساس توالي بخشي از ژن كدكننده اكتين طراحي گرديدند كه به ترتيب قطعاتي به طول‎هاي 500 جفت باز (. fijiensis M)، 200 جفت باز (musicola M.) و 630 جفت باز (M. eumusae) را تكثير كردند. كارآيي آغازگرهاي اختصاصي هرگونه روي DNA استخراج شده از كشت‎هاي خالص و بافت‎هاي برگ‎هاي آلوده گياه ميزيان، آزمايش و تاييد شدند. نتايج حاصل از بررسي ميزان حساسيت آغازگر ها نشان داد كه آغازگرهاي اختصاصي طراحي شده براي هر يك از گونه‎هاي M. Musicola، M. fijiensis و M. eumusae به ترتيب توانايي تكثير قطعه مورد نظر با غلظت‎هاي 100، 10 و يك پيكوگرم DNA از گونه هدف را دارا هستند.

The Sigatoka disease complex of banana involves three related ascomycetous fungi viz., Mycosphaerella fijiensis, M. musicola, and M. eumusae. Due to rather similar symptoms on banana, similar teleomorph morphology and problems associated with growth and sporulation in culture, species identification based on classical methods is troublesome. The exact distribution of these three species and their disease epidemiology remain unclear. Furthermore, M. fijiensis and M. eumusae have not been reported from many banana producing countries, so as to be considered as quarantine organisms. Rapid and accurate detection of these three species is essential to adopt and apply proper disease management strategy. In the present study, species-specific primer sets were developed as based on sequence data of actin gene. Species-specific primer combinations were designed with expected amplicon sizes of 500 bp from M. fijiensis, 200 bp from M. musicola, and 630 bp for M. eumusae. Accuracy and efficacy of each of species-primer sets were tested and verified on DNA extracted from pure cultures as well as DNA from naturally infected banana leaves. The sensitivity of the primer sets enabled reliable detection of M. fijiensis DNA as low as 100 pg, whereas for M musicola and M. eumusae a higher sensitivity was achieved of 1 pg and 10 pg genomic DNA, respectively