كلون‌سازي و مطالعه بيان فاكتور بافتي نوتركيب در سلول‌هاي يوكاريوتيك CHO

كلون‌سازي و مطالعه بيان فاكتور بافتي نوتركيب در سلول‌هاي يوكاريوتيك CHO

چكيده سابقه و هدف فاكتور بافتي(TF)، اصلي‌ترين آغازكننده آبشار انعقادي است. براي بررسي مسير خارجي انعقاد، اندازه‌گيري زمان پروترومبين بهترين روش است كه در اين روش با توجه به TF به كار گرفته شده، نوساناتي در نتيجه آزمايش ديده مي‌شود. در اين مطالعه با هدف دستيابي به نتايجي با تكرارپذيري بيشتر، از TF نوتركيب استفاده شده است. مواد و روش‌ها مطالعه انجام شده از نوع تجربي بود. cDNA فاكتور بافتي در پلاسميد pcDNA3.1 كلون و به سلول‌هاي CHO منتقل گرديد. پروتيين‌هاي سلول‌هايCHO ترانسفكت شده استخراج و پس از جداسازي با روش SDS-PAGE با وسترن بلات آناليز شدند. سلول‌هاي CHO كهTF را بيان مي‌كردند در حضور كلروركلسيم به پلاسماي سيتراته افزوده شدند و زمان لخته شدن پلاسما ثبت گرديد. فعال‌سازي فاكتور VII در پلاسما با روش الايزا مورد بررسي قرار گرفت. يافته‌ها در آناليز پروتيين‌هاي جدا شده از سلول‌هاي ترانسفكت شده با روش SDS-PAGE ، باندي حدود 40 كيلودالتون مشاهده شد كه با آنتي‌بادي مونوكلونال TF در آناليز وسترن بلات مورد تاييد قرار گرفت. زمان انعقاد پلاسما در مقايسه با سلول‌هاي CHO ترانسفكت نشده, از 3 دقيقه به 3 ± 21 ثانيه كاهش يافت. هم چنين اضافه كردن غشاي اين سلول‌ها به پلاسما در حضور كلرور كلسيم، موجب فعال‌سازي فاكتور VII به ميزان ng/ml 35 ±810 شد. نتيجه گيري TF نوتركيب بيان شده در سلول‌هاي CHO ، قادر به لخته كردن پلاسماي سيتراته و فعال سازي فاكتور VII بود.

Abstract Background and Objectives Tissue factor (TF), a 45-kDa transmembrane glycoprotein, is the major cellular initiator of the coagulation cascade. Prothrombin Time (PT) is the test that evaluates extrinsic pathway of coagulation. Thromboplastin used in this test is mostly prepared of rabbit brain. Thus it causes variation in the PT results. There is an important advantage of using recombinant TF in PT test to get more reproducible results. Materials and Methods TF mRNA was isolated from human lung fibroblast cells. After preparation of cDNA it has cloned in pcDNA3 plasmid. CHO cells were transfected with recombinant plasmid. Transfected cells were grown in presence of Geneticin. Total proteins were extracted from CHO cells and separated with SDS/PAGE electrophoresis and analyzed by western blotting technique. CHO cells expressing TF were added to citrated plasma in presence of CaCl2 and clotting time was measured. In addition, factor VII activation by recombinant TF in the plasma was assessed by ELISA method. Results Extracted proteins from tarnsfected CHO cells separated on SDS/PAGE showed an approximately 40-kDa band that verified with a monoclonal antibody against TF on western blot analysis. Adding transfected cells (106cell/ml) to the citrated plasma in presence of CaCl2 could decrease clotting time from 3 minutes to 21 ± 3 seconds compared with untransfected CHO cells. The level of factor VIIa in citrated plasma was 810 ± 35 ng/ml in presence of transfected cells’ membrane. Conclusions Recombinant TF expressed in CHO cells was able to clot citrated plasma and to activate factor VII.