مرکز منطقه ای اطلاع رساني علوم و فناوري - بررسي ساختار ژنتيكي جمعيت ماهي سفيد (Rutilus frisii kutum ) در سواحل استان گلستان با استفاده از نشانگر ريزماهواره

چكيده فارسي :

به منظور تعيين تنوع ژنتيكي جمعيت¬هاي ماهي سفيد 25 نمونه ماهي از رودخانه¬هاي گرگانرود و قره‌سو در فروردين ماه سال 1385 صيد و DNA ژنومي قطعات باله دمي از طريق روش فنل-كلروفرم استخراج و با استفاده از ده جايگاه ژني ريزماهواره‌اي مورد بررسي قرار گرفت. ده جايگاه ژني مورد بررسي پلي¬مورف بودند و در هر دو منطقه تنوع نشان دادند. محدودة تعداد آلل در سطح مناطق 13-4 و محدودة هتروزيگوسيتي مشاهده شده در ده جايگاه ژني مورد بررسي 00/1-22/0 بدست آمد. مقدار FST بين جمعيت¬ها 014/0 بود (05/0P<). آناليز توزيع تنوع ژنتيكي نشان داد كه ميزان تنوع درون جمعيتي بسيار بالاست (99 درصد) در حاليكه تنوع بين جمعيتي پايين است (1درصد). انحراف از تعادل هاردي- واينبرگ بالايي در هر دو جمعيت ديده شد. نتايج فوق نشان مي¬د¬هند كه اين گونه هنوز از تنوع ژنتيكي نسبتاٌ مناسبي برخوردار است و همچنين با توجه به دندروگرام UPGMA ترسيم شده براساس مقدار فاصله ژنتيكي كه مناطق را در دو شاخه جدا قرار داد به نظر مي¬رسد بيش از يك جمعيت ماهي سفيد در سواحل استان گلستان وجود دارد. ماهي سفيد به لحاظ ميزان صيد و قيمت فروش مهمترين ماهي براي صيادان محسوب مي‌گردد و بيش از 60 درصد صيد كل ماهيان استخواني در سواحل ايراني خزر را تشكيل مي‌دهد. تحقيقات صورت گرفته نشان مي¬دهد كه رشد در اين گونه در مقايسه با سالهاي گذشته بطور بارزي كاهش يافته است، به اين صورت كه افزايش وزن و طول برحسب سن بتدريج روند نزولي پيدا كرده است (ولي¬پور و خاني¬پور، 1388). اين امر بطور مشخص مي¬تواند مربوط به برنامه‌هاي بازسازي و تكثير مصنوعي باشد كه هر ساله توسط مراكز تكثير و بازسازي ذخاير سازمان شيلات ايران انجام مي‌شود. تنوع ژنتيكي منابع دريايي اهميتي حياتي براي مديريت و حفاظت از آنها دارد زيرا اولين پيش¬نياز براي حفظ سازگاري جمعيت-ها، در شرايط محيطي در حال تغيير است (Diz & Presa, 2009). برنامه¬هاي بازسازي به منظور افزايش گونه¬هاي وحشي انجام مي¬شوند اما نتيجه آنها اغلب منجر به كاهش تنوع ژنتيكي درون جمعيتي ذخاير ژني بومي و در نهايت انقراض جمعيت¬هاي محلي مي¬شود (Machado et al., 2007). متاسفانه تنها اطلاعات موجود در مورد ماهي سفيد مربوط به بررسي تنوع ژنتيكي نژادهاي بهاره و پاييزه اين گونه مي¬باشد (چكمه¬دوز و همكاران، 1387) و تاكنون اطلاعاتي در مورد ساختار ژنتيكي ماهي سفيد در ميان مناطق مختلف منتشر نشده است. با توجه به اينكه اثر روش¬هاي تكثير مصنوعي بر ذخاير ژنتيكي آبزيان ثابت شده و تكثير طبيعي ماهي سفيد از مدت¬ها قبل به شدت كاهش يافته است و در حال حاضر نيز بيشتر ذخاير اين گونه از طريق تكثير مصنوعي ازدياد مي¬شوند، اطلاع از وضعيت ژنتيكي اين گونه و تشخيص جمعيت¬هاي مختلف آن براي استفاده در برنامه¬هاي بازسازي ذخاير و حفظ تنوع اين گونه ارزشمند بسيار ضروري مي¬باشد. نمونه¬هاي ماهي از داخل رودخانه¬هاي گرگانرود (25 نمونه) و قره¬سو (25 نمونه) (با فاصله حدود 20 كيلومتر) در اوايل فروردين 1385 صيد شدند. DNA هسته¬اي قطعه¬اي از باله دمي با استفاده از روش فنل-كلروفرم استخراج گرديد (Hillis et al., 1996). ده جايگاه ژني ريز¬ماهواره¬اي (Ca1، Ca3، CypG3، CypG24،CypG27،CypG30،Lid1،Rru2، Rru4، Z21908) كه در ماهي كلمه Rutilus rutilus حالت پلي¬مورف نشان داده بودند انتخاب شدند (Hamilton & Tyler, 2008). شرايط سيكل دمايي براي هر جايگاه ژني عبارت بود از 3 دقيقه در 94 درجه در ادامه 35 سيكل شامل 94 درجه براي 30 ثانيه، درجه¬ حرارت اتصال 30 ثانيه و 72 درجه براي 1 دقيقه، با يك بسط نهايي 72 درجه براي 3 دقيقه. محصولات واكنش زنجيره‌اي پليمراز روي ژل پلي¬آكريل¬آميد 10 درصد (غير يونيزه) جداسازي شدند. از ماركر DNA (Fermentas bp 50(Ladder بعنوان شاخص براي تعيين اندازه آللي استفاده شد. در ادامه ژل¬ها با استفاده از روش نيترات نقره (Bassam et al., 1991) رنگ آميزي شدند و پس از تهيه تصوير آنها توسط دستگاه مستند¬ساز ژل، از نرم¬افزار ژل پرو آناليزر (Gel pro analyser) براي محاسبه طول قطعات و تعداد آلل¬ها استفاده گرديد. فراواني آللي و هتروزيگوسيتي براي هر جمعيت در هر جايگاه ژني همچنين تست انحراف از تعادل هاردي- واينبرگ با استفاده از نرم‌افزار Genepop 3.1 محاسبه گرديد (Raymond & Rousset, 1995). بسته نرم¬افزاري GenALEx (Peakall & Smouse 2006) براي تعيين مقدار FST (تمايز ژنتيكي زير جمعيت¬هاي درون جمعيت كل بر طبق مدل آللي بي¬نهايت (IAM)) براساس فراواني و همچنين تعيين ميزان تنوع ژنتيكي درون و بين جمعيتي و تعيين ميزان تمايز بين جمعيت¬ها براساس مقادير FST و RST (تمايز زير جمعيت¬ها براساس مدل جهش پله¬اي (SMM)) با استفاده از آناليز واريانس مولكولي (AMOVA) مورد استفاده قرار گرفت. تعيين مقادير فاصله و شباهت ژنتيكي نئي (Nei, 1972) و تعيين رابطه فيلوژنيك بين جمعيت¬ها با استفاده از ترسيم درخت UPGMA نيز با استفاده از نرم¬افزار PopGene صورت گرفت (Yeh et al., 1999). هر ده جايگاه ژني مورد بررسي در ماهي سفيد پلي¬مورف بودند. در مجموع حدود 95 آلل مختلف با محددة اندازه¬ 308-104 جفت باز در كل جايگاه¬هاي ژني بدست آمد. دامنه هتروزيگوسيتي مشاهده شده در بين مناطق 1-12/0 با ميانگين 76/0 محاسبه گرديد. از مجموع 20 تست تعادل هاردي- واينبرگ همه به جز 3 مورد انحراف از تعادل را نشان دادند (جدول 1). جدول 1: تنوع ژنتيكي 10 جايگاه ژني مورد مطالعه در جمعيت¬هاي ماهي سفيد Ca1 Ca3 CypG3 CypG24 CypG27 CypG30 Lid1 Rru2 Rru4 Z21908 قره سو Na 8 13 10 13 12 8 8 8 4 4 Ne 88/4 25/9 02/7 12/9 37/6 71/4 18/7 15/6 54/3 53/2 Ho 00/1 88/. 52/0 00/1 56/0 32/0 56/0 00/1 00/1 00/1 He 79/0 89/0 85/0 89/0 84/0 78/0 86/0 83/0 71/0 60/0 FIS 25/0- 01/0 39/0 12/0- 33/0 59/0 34/0 19/0- 39/0- 65/0- pHw ns ** *** * *** *** *** *** *** *** گرگانرود Na 6 11 10 11 10 5 8 10 4 5 Ne 31/4 27/5 94/6 86/7 61/6 98/2 04/5 14/7 94/2 86/2 H0 00/1 80/0 52/0 00/1 52/0 12/0 48/0 00/1 00/1 00/1 He 76/0 81/0 85/0 87/0 84/0 66/0 80/0 86/0 66/0 65/0 FIS 30/0- 01/0 39/0 14/0- 38/0 81/0 40/0 16/0- 51/0- 53/0- pHw ns * *** ns *** *** *** ** *** *** Na: تعداد آلل، Ne: تعداد آلل موثر Ho: هتروزيگوسيتي مشاهده شده، He: هتروزيگوسيتي مورد انتظار، Fis: شاخص درون¬آميزي pHw: تست احتمال هاردي- واينبرگ Ns): عدم معني¬داري، 05/0 P?*، 01/0 P?**، 001/0P? ***) از نظر تمايز بين مناطق مقدار FST از طريق فراواني 017/0 بدست آمد. بررسي نتايج FST حاصل از آناليز واريانس مولكولي نشان مي¬دهد كه مقدار تنوع ‍ژنتيكي درون جمعيتي بالا (99 درصد) در حاليكه مقدار تنوع بين جمعيت¬ها بسيار پايين (1 درصد) مي¬باشد. در زمينه تعيين ميزان تمايز بين مناطق نيز مقدار FST 014/0، 05/0P? و مقدار RST 022/0، 05/0P? بدست آمد. براساس معيار فاصله ژنتيكي (Nei, 1972) ميزان شباهت ژنتيكي بين دو منطقه 86/0 و مقدار فاصله ژنتيكي 14/0 بدست آمد. دندروگرام UPGMA ترسيم شده براساس مقدار فاصله ژنتيكي نشان مي¬دهد كه اين دو منطقه در دو شاخه جدا قرار مي¬گيرند (شكل 1) تنوع ژنتيكي يكي از سه سطح تنوع زيستي پيشنهاد شده توسط اتحاديه بين¬المللي حفاظت از گونه¬ها و طبيعت (IUCN) براي برنامه‌هاي حفاظت ذخاير است (Lucentini et al., 2009). جرياني به سمت افزايش تنوع ژنتيكي از ماهيان آب شيرين به آنادراموس و ماهيان درياي وجود دارد كه در مقادير متوسط هتروزيگوسيتي بدست آمده در اين سه منطقه (هتروزيگوسيتي: 54/0، 68/0 و 77/0) و همچنين در ميانگين تعداد آللها در جايگاه¬هاي ژني (تعداد آلل: 1/9، 8/10 و 9/19) مشخص شده است (Dewoody & Avise, 2000). بطور كلي در اثر انحراف ژنتيكي آللهاي با فراواني پايين (آللهاي نادر) ابتدا حذف مي¬شوند. از اينرو در جمعيت¬هايي كه اخيراً اندازه آنها كاهش يافته است بعلت افزايش انحراف ژنتيكي در مقايسه با جمعيت¬هاي ثابت كسري آلل¬هاي نادر مشاهده خواهد شد (Garza & Williamson, 2001). با مقايسه نتايج بدست آمده مي¬توان نتيجه گرفت كه هتروزيگوسيتي مشاهده شده در اين گونه نسبت به ساير ماهيان آنادراموس در حد مناسب ولي تعداد آلل تا حدودي پايين مي¬باشد. تحقيقات نشان مي¬دهند كه تعداد آلل براي ارزيابي تنوع نمونه¬ها نسبت به هتروزيگوسيتي مناسبتر است (Diz & Presa, 2009). تكثير مصنوعي ماهي سفيد از حدود 30 سال پيش شروع شده و با توجه به نبود شرايط لازم براي تكثير طبيعي اين گونه به نظر مي¬رسد جمعيت حاصل از تكثير مصنوعي بتدريج در حال غالب شدن در درياي خزر مي‌باشد (ولي¬پور و خاني¬پور، 1388). با توجه به كاهش شديد تكثير طبيعي ماهي سفيد و مدت زمان طولاني تكثير مصنوعي اين گونه و عدم امكان استفاده از تمام مولدين و نسبت¬هاي جنسي برابر در زمان تكثير و همچنين نتايج بدست آمده در اين بررسي كه كم بودن تعداد آلل¬ها را نشان مي¬دهد، به نظر مي‌رسد كه جمعيت ماهي سفيد ساكن در درياي خزر دچار كاهش اندازه جمعيت موثر شده و علائمي از بروز تنگناي ژنتيكي ناشي از عمليات تكثير مصنوعي را نشان مي¬دهند. در اين بررسي در اكثر جايگاه¬هاي ژني انحراف از تعادل ديده شد، همچنين جايگاه¬هاي ژني Ca3، CypG3، CypG27، CypG30 و Lid1 درصد بالايي از كسري هتروزيگوسيتي را نشان دادند. طبق فرضيه‌هاي عنوان شده توسط Rico و همكاران در سال 1997 دلايل متفاوتي را مي¬توان براي كسري هتروزيگوسيتي ذكر كرد: - آللهاي نول: در نتايج بدست آمده از اين تحقيق كسري هتروزيگوسيتي بالايي در جايگاه¬هاي ژني مختلف در تمام نمونه‌ها ديده شد. با توجه به بالا بودن مقدار آن اثر آلل¬هاي نول را در ايجاد اين حالت نمي‌توان ناديده گرفت. - تنگناي ژنتيكي: بيشتر در افزايش ذخاير ديده مي‌شود. هنگامي كه از تعداد مولدين كم تعداد زيادي لارو توليد مي‌كنند كه اين لاروها بخش اصلي نسل بعدي را تشكيل مي‌دهند. شكل 1: دندروگرام UPGMA ترسيم شده بر اساس فاصله ژنتيكي يك عامل به تنهايي نمي¬تواند انحراف از تعادل را توضيح دهد اما افزايش جريان ژني و بروز تنگناي ژنتيكي ناشي از عمليات تكثير مصنوعي و بازسازي ذخاير ماهي سفيد را مي¬توان از مهمترين عوامل موثر در آن دانست. معمولاٌ در بررسي‌هاي جمعيتي ميزان FST شاخص مهمي جهت تمايز و تفكيك ژنتيكي بين جمعيت¬ها مي¬باشد (Ballox & Lugon-Moulin, 2002). ميزان FST بدست آمده (014/0) در اين بررسي نشان‌دهندة تمايز بسيار پايين اما معني¬دار (05/0P<) بين دو منطقه است. براساس معيار Wright در سال 1978 مقادير FST از صفر تا 05/0 ميزان كم تمايز ژنتيكي، 05/0 تا 15/0 مقدار متوسط و 15/0 تا 25/0 مقدار بالاي تمايز را نشان مي¬دهد. نتايج حاصل از آناليز AMOVA نشان داد كه 99 درصد تنوع به درون جمعيت¬ها و 1 درصد به بين جمعيت¬ها مربوط مي-شود. بالاتر بودن تنوع درون جمعيتي نسبت به بين جمعيتي نشان مي‌دهد كه در بين جمعيت¬هاي مختلف ساختار ژنتيكي بارزي وجود ندارد ( Diz & Presa, 2009). در اين بررسي ميزان RST 022/0 بدست آمد. بنابراين مقادير پايين FST (05/0P<) و RST (05/0P>) نشان‌دهندة تمايز پايين ميان دو منطقه است. دليل پايين بودن تمايز بين مناطق را مي¬توان ناشي از مهاجرت و جريان ژني طبيعي بين آنها دانست. البته نحوة رهاسازي لاروها نيز مي¬تواند دليلي براي كاهش آن باشد زيرا لاروهاي بدست آمده از رودخانه¬هاي مختلف را بدون در نظر گرفتن محل صيد مولدين رهاسازي مي¬كنند كه اين امر باعث بالا رفتن تبادل ژني بين ماهيان مناطق مختلف مي¬شود.Thrope و Sol-cava در سال 1994 نشان دادند كه مقادير فاصله ژنتيكي نئي (Nei, 1972) براي جمعيت‌هاي هم¬ گونه بطور ميانگين 05/0 (محدودة 002/0-07/0)، براي گونه¬هاي همجنس بطور ميانگين 30/0 (محدودة 03/0-61/0)، براي جنس¬هاي هم خانواده محدوده¬ از 58/0 تا 21/1 مي¬باشد. مقادير فاصله بدست آمده در اين بررسي در محدودة گونه‌هاي هم¬جنس قرار مي¬گيرند ولي مقدار آن پايين مي¬باشد. دندروگرام UPGMA بدست آمده نشان مي¬دهد كه احتمالاٌ دو جمعيت مجزا از ماهي سفيد در آبهاي گلستان وجود دارد. مسلماً بهترين روش براي حفاظت از ماهي سفيد بازسازي محل¬هاي تخمريزي طبيعي اين گونه است. با توجه به ضرورت تكثير مصنوعي مد نظر قرار دادن جدايي جمعيت¬هاي مختلف اين گونه در زمان تكثير و رهاسازي لاروها و همچنين استفاده از حداكثر تعداد مولدين ضروري مي¬باشد.