تعيين و مقايسه الگوي مولكولي جدايه‌هاي كلادوسپوريوم كاريوني و آلترناريا آلترناتا با استفاده از روش RAPD-PCR

تعيين و مقايسه الگوي مولكولي جدايه‌هاي كلادوسپوريوم كاريوني و آلترناريا آلترناتا با استفاده از روش RAPD-PCR

در سال‌هاي اخير شيوع آلرژي‌هاي تنفسي قارچي بشدت افزايش يافته است از آنجايي كه كلادوسپوريوم كاريوني و آلترناريا آلترناتا از مهمترين آلرژن‌هاي قارچي مي باشند و همچنين متدهاي معمول در تشخيص آزمايشگاهي آنها داراي محدوديت مي‌باشند، لذا جهت بهبود بخشيدن براي تعيين هويت اين قارچ‌ها از متدهاي مولكولي استفاده شد. هدف از اين تحقيق تعيين الگوي مولكولي داخل گونه‌اي براي آلترناريا و كلادوسپوريوم‌ها و همچنين مقايسه اختلافات و اشتراكات بر اساس الگوي مولكولي ميان سه ايزوله آلترناريا آلترناتا و سه ايزوله كلادوسپوريوم كاريوني كه قبلا توسط مركز قارچ شناسي لندن تاييد شده بودند، مي‌باشد. در اين برسي ايزوله‌هاي مذكور در محيط سابوروبراث كشت انبوه داده وDNA با روش فنل استخراج گرديد. DNA استخراج شده با روش RAPD-PCR با استفاده از 4 پرايمر مورد ارزيابي قرار گرفت. نتايج RAPD-PCR با جدايه‌هاي كلادوسپوريوم كاريوني با استفاده از چهار پرايمر نشان داد كه دو جدايه داراي الگوي مولكولي مشابه اما متفاوت از الگوي مولكولي جدايه سوم مي‌باشند. نتايج RAPD-PCR با جدايه‌هاي آلترناريا آلترناتا با استفاده از چهار پرايمر نشان داد كه هر سه جدايه داراي الگوي مولكولي قابل مقايسه با يكديگر بوده و تفاوت‌هاي كمي كه در بعضي از آزمايشات بر روي ژل آگارز مشاهده مي‌گردد در نتيجه تكرارپذيري پايين روش كار مي‌باشد. جالب توجه اينكه مقايسه نتايج RAPD-PCR با دو جدايه كادوسپوريوم كاريوني كه داراي الگوي مولكولي مشابه بودند، با سه جدايه آلترناريا آلترناتا نشان داد كه محصولات PCR حاصله با پرايمرهاي CLN1 و CLN3 و CLN4 قابل مقايسه و با پرايمر CLN2 حداقل با دو جدايه آلترناريا آلترناتا قابل مقايسه مي‌باشند. اين نتايج نشان مي‌دهند كه با توجه به حساسيت بالاي روش كار و دخالت داشتن عوامل متعدد در تامين شرايط تكرارپذيري نتايج كار، اين روش در ارتباط با جدايه‌هايي مورد استفاده قرار گيرد كه روش‌هاي مولكولي اختصاصي تري براي آنها در دست نباشد.

Cladosporium carionii and Alternaria alternata are the most significant agents causing respiratory allergies in human. In the recent years, the prevalence of fungal respiratory allergies increased. Cladosporium carionii and Alternaria alternata are the most important fungal aeroallergens. Their diagnosis is (culture and morphological characteristics) time-consuming in and the serological methods have certain restrictions due to some cross reactions. The best diagnosis method to detect these fungi seems to be PCR. The present study aimed to identify of DNA fragment patterns of intra-species for Alternaria alternata and Cladosporium carionii produced by RAPD-PCR and compare the DNA pattern between the two genera Alternaria alternata and Cladosporium carionii isolated from different parts of Iran. In this study, the isolated fungi were cultured massively in saburose broth. After characterization of fungi, the DNA was extracted using Phenol extraction method. Extracted DNA was amplified using 4 primer pairs in RAPD-PCR. RAPD-PCR showed that two isolates of Cladosporium carionii had similar molecular pattern but they were different from the third’s isolate. Furthermore, the results revealed that all three isolates of Alternaria alternata had comparable molecular pattern. But some differences could also be observed between Alternaria alternata species. The observed difference between the studied Alternaria species is most probably due to the low ability of RAPD-PCR technique to produce the reproducible results. RAPD-PCR results between two Cladosporium carionii isolates with similar pattern and three Alternaria alternata isolates indicate that the PCR products using CLN1, CLN3 and CLN4 primers is comparable with each others. The PCR products from DNA isolated from the abovementioned two Cladosporium carionii amplified using CLN2 primer pair were comparable at least only with two isolates of Alternaria alternata. According to the high sensitivity of RAPD-PCR method and interference of several factors in providing special condition for reproducibility of the results, we would recommend this method for use only in studies of fungi with poor knowledge about their genome.