ساخت پلاسميد حاوي Large T antigen كوتاه شده و مبدا همانندسازي ويروس 40SV و ارزيابي قابليت تكثير اين پلاسميد در رده سلولي 293HEK و CHO

Constructing a plasmid contains truncated t antigen and sv40 origin of replication and evaluation of its replication in hek293 and cho

هدف از اين مطالعه طراحي و ساخت پلاسميدي با مبدا همانندسازي 40SV و ژن جهش يافته LTag ويروس 40SV جهت دستيابي به ناقلي ايمن است كه بتواند به صورت اپي زومال كاملا توسط عنصرهاي ترانس سلول‌هاي يوكاريوتي شناسايي، همانندسازي شود و قدرت اتصال به پروتيين‌هاي 53P و Rb را نداشته باشد تا به توان از آن در ژن درماني و توليد پروتيين‌هاي نوتركيب استفاده نمود.جهش‌هاي مناسب براي ايجاد LTag ايمن با استفاده از نرم افزار Modeller بررسي و در نهايت دو نوع جهش مناسب در توالي نوكليوتيدي ژن LTag با روش PCR ايجاد و ژن جهش يافته LTag درپلاسميد EGFP-2ESIR كلون شد. تمام كلون‌ها با روش PCR‌، هضم آنزيمي و تعيين توالي بررسي گرديدند. سلول‌هاي 293HEK و OCH با سازه نهايي ترانسفكت و با ميكروسكوپ فلورسانت به مدت چهل روز مشاهده شدند. از سلول‌هاي باقي مانده پلاسميد و DNA ژنوميك تخليص و بر روي آن‌ها PCRهاي همپوشان به منظور اثبات حلقوي بودن پلاسميدها انجام شد.نتايج حاصل از PCR، هضم آنزيمي و تعيين توالي همگي تاييد كننده صحت انجام سازه و نتايج حاصل از ترانسفكشن سلول‌هاي 293HEK و CHO نشان گر همانندسازي پلاسميد در سلول‌هاي فوق مي‌باشد.

The aim of study is designing and construction of a plasmid containing mutated LTag and replication ori of SV40 to develop a safe vector which can be recognised and replicated episomally by trans elements of eukarytic cells. Because it has not ability to interact with P53 and Rb, its safe application in gene therapy and recombinant protein production is possible.Suitable mutants for creating of safe LTag was analyzed by MODELLER software and finally two appropriate structure were selected. Desired mutations were created in the nucleotide sequence of LTag by PCR method. Mutated LTag gene was cloned in to the IRES2-EGFP. All clones were analyzed by PCR, restriction analysis and sequencing. HEK293 and CHO cell lines were transfected by final construct and transfected cells were observed by flourescent microscope for 40 days. Plasmid and Genomic DNA was extracted from remained cells and overlap PCRs performed on them to confirm their circularity.The results of PCR, restriction analysis and sequencing confirm the muthenticity of construct. The transfection of HEK293 and CHO cell lines showed replication of constructed plasmid in them. This plasmid, contains mutated LTag and replication ori of SV40, can be replicated in eukarytic cells and then can be used in gene therapy and recombinant protein production with high safety.