كلونينگ، افزايش بيان، تخليص و مدل سازي مولكولي فتوپروتيين نميوپسين 2 از شانه دار نميوپسيس ليدي

Cloning, over expression, purification and molecular modeling of a mnemiopsin 2 photoprotein from the Ctenophore Mnemiopsis leidyi

به توانايي موجودات زنده براي نشر نور مريي از طريق سيستم واكنش‌هاي لومينسانس شيميايي را بيولومينسانس مي‌گويند. نميوپسين 2 فتو پروتييني است كه از شانه دار نميوپسيس ليدي كشف گرديده كه نور را از طريق واكنش با كلسيم منتشر مي‌كند. اين پروتيين عضو خانواده فتو پروتيين‌هاي با قابليت اتصال به كلسيم نظير aequorin، mitrocomin، obelin و berovin مي‌باشد. ژن نميوپسين 2 از شانه دار دريايي نميوپسيس ليدي بوده و بعد از شناسايي و جداسازي، در بانك ژن با كد 884175 ثبت شد. هدف از اين تحقيق ساب كلونينگ ژن نميوپسين در وكتور بياني pET28a، و انتقال به باكتري E.coli، سويه BL21-DE3 و افزايش ميزان بيان آن تحت شرايط مختلف (غلظت‌هاي مختلف IPTG ،دما، مدت زمان القاي) مي‌باشد. پس از انجام مراحل ذكر شده تخليص پروتيين با استفاده از روش كروماتوگرافي تمايلي با دنباله هيستيديني انجام شده و نهايتا با استفاده از روش SDS-PAGE احيايي نتايج مورد آناليز قرار گرفت. تطبيق توالي نميوپسين 2 با ساير فتو پروتيين‌ها به كمك برنامه CLUSTALW و ESPript2.2. انجام و درخت فيلوژنيك با استفاده از متد neighbor- joining و با نرم افزار Mega 4.0.2 رسم گرديد. مدل ساختار سه بعدي پروتيين با استفاده از برنامهMODELLER بر اساس berovin و aequorin ايجاد شد.

Bioluminescence is the capacity of living organisms to emit visible light through a variety of chemiluminescent reaction systems. mnemiopsin 2 is a photoprotein that was discovered in the luminous Ctenophore mnemiopsis leidyi and emits light through interacting with Ca2+. It is a member of the calcium-binding photoprotein family including aequorin, mitrocomin, obelin and berovin. After identification and gene extraction, mnemiopsin 2 from the ctenophore mnemiopsis leidyi, was submitted in the Genbank (GQ884175) and its sequence was subcloned in the expression vector, pET28a, then transformed in the Bl21-DE3. To optimization, expression was carried out in different conditions (IPTG concentration, temperature, time course of induction). The protein was purified with Ni-NTA affinity chromatography, afterwards, SDS-PAGE analysis was carried out under reducing conditions. alignment of mnemiopsin 2 was performed with other photoproteins using CLUSTAL W program and ESPript 2.2, thereafter, the phylogenic tree was drawn using neighbor-joining method by Mega 4.0.2 software. A three-dimensional structure model of mnemiopsin 2 was constructed using the MODELLER program based on berovin (PDB ID: 2HPK) and aequorin structures (PDB ID: 1EJ3).